黑曲霉D2-26乳糖酶分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、乳糖酶是一種水解酶，目前主要應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、分析等領(lǐng)域。本研究以酶工程實(shí)驗(yàn)室所保存的一株黑曲霉D2-26為出發(fā)菌株，采用10L發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)乳糖酶，建立了一套簡(jiǎn)單易行的乳糖酶提取純化方法并對(duì)純酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)研究。黑曲霉D2-26乳糖酶是胞外高溫乳糖酶，具有生產(chǎn)成本低、提取純化工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好、在生產(chǎn)中可以有效防止雜菌污染等特點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。 黑曲霉D2-26乳糖酶經(jīng)過(guò)濾、超濾、硫酸銨分級(jí)鹽析、Sephadex

2、G-25脫鹽、DEAE-纖維素-32離子強(qiáng)度梯度層析、SephadexG-100凝膠過(guò)濾、DEAE-纖維素-32pH梯度層析等純化工藝分離純化之后，經(jīng)PAGE電泳鑒定得到單一條帶，達(dá)到電泳純。比活力提高到705.91U/mg，比初始發(fā)酵液比活提高了43.7倍多。 純化的黑曲霉D2-26乳糖酶以O(shè)NPG為底物時(shí)的酶學(xué)性質(zhì)為：最適溫度70℃，作用溫度較廣，在40～70℃都具有較高的酶活性；在30～60℃有較高的耐受性，在30～50℃

3、范圍內(nèi)處理120min，殘留酶活均在90﹪以上，在60℃下處理相同時(shí)間其其殘留酶活為73.42﹪；在4℃冷藏條件下具有良好的穩(wěn)定性，乳糖酶蛋白在低溫貯存20天后酶活才開(kāi)始降低；最適pH為2.5，作用范圍較寬，在pH2～4.5范圍內(nèi)均具有較高的酶活性；在pH2～9條件下貯存2d其相對(duì)酶活力均在70﹪以上，具有較好的pH耐受性；Mn2+對(duì)乳糖酶有顯著激活作用，可使其酶活提高44.94﹪，并且許多金屬離子都能夠在一定程度上提高其酶活性，Hg2

4、+、pb2+對(duì)酶活有較強(qiáng)的抑制作用；SDS對(duì)酶蛋白的變性作用嚴(yán)重抑制其酶活性，半乳糖對(duì)黑曲霉D2-26乳糖酶有一定的產(chǎn)物抑制作用，EDTA不影響乳糖酶的活性；以O(shè)NPG為底物采用雙倒數(shù)作圖法測(cè)得Vmax為97nmol/min，Km為8.77mmol/L；SDS-PAGE電泳顯示黑曲霉D2-26乳糖酶分子量116.978KD，為單亞基蛋白；硫酸-苯酚法測(cè)得其糖基化程度為11.3﹪。 本論文對(duì)乳糖酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)做了基礎(chǔ)性研究