高通量測序技術(shù)應(yīng)用于野生動物糞便中病毒的發(fā)現(xiàn)與分析.pdf

1、隨著現(xiàn)代生命科學研究與生物學技術(shù)的快速發(fā)展，新病毒及一些熟知病毒的新型別不斷發(fā)現(xiàn)。Anthony等研究人員估計，哺乳動物中極有可能潛伏著超過32萬種人類未知的病毒。這些發(fā)現(xiàn)的許多新發(fā)與再發(fā)病毒均對人類健康存在著極大的威脅，也存在著非常嚴重的社會公共衛(wèi)生安全隱患，如埃博拉病毒、丙型肝炎病毒、艾滋病毒、SARS病毒等。因此，發(fā)現(xiàn)并鑒定新病毒與其疾病相關(guān)性對預防、診斷和治療新發(fā)病毒性傳染病具有重大意義。傳統(tǒng)意義上有很多用于發(fā)現(xiàn)新病毒的方法，如

2、病毒分離、核酸檢驗、血清學試驗等，但它們都有一定的局限性。近年來基于高通量測序的病毒宏基因組學已經(jīng)成為一種新技術(shù)，即直接以樣品中所有病毒遺傳物質(zhì)作為研究對象，將PCR產(chǎn)物簡單處理后直接進行測序，一次反應(yīng)即可獲得大量的核酸序列信息，從而快速鑒定出所有病毒的組成，其操作較簡單、檢測成本較低，具有較高的實用價值。
　　熱帶、高原等特殊氣候地理環(huán)境的某些重要野生動物，可攜帶和傳播烈性病原體。西方國家對北美大草原旱獺（又稱土撥鼠）的研究非常

3、重視，并在旱獺中分離到引起腦炎的Powassan virus(POW)、狂犬病毒、土撥鼠肝炎病毒（包括乙肝病毒和丁肝病毒）等。但我國對這方面的研究開展較少，特別是對青海喜馬拉雅野生旱獺攜帶的病毒譜的研究從未有過相關(guān)報道，因此，青海喜馬拉雅旱獺糞便中的病毒譜研究，對于發(fā)現(xiàn)潛在的人類新發(fā)病毒性疾病具有重大的意義。
　　本研究以野生旱獺的糞便標本作為研究對象，建立適用于Miseq高通量測序技術(shù)的糞便標本處理方法，通過對實驗所得的測序序列

4、采用生物信息學分析，研究野生旱獺糞便中的病毒譜，發(fā)現(xiàn)其中未知的新病毒。并進一步運用分子生物學、生物信息學等方法，研究新病毒的基因結(jié)構(gòu)、分子流行病學等特點，初步了解新病毒感染人類以及其它動物的可能性。實驗通過Miseq高通量測序，獲得5742980條讀長(Reads)，去除未分類序列、細菌、噬菌體等無關(guān)序列后，10074條序列注釋為病毒，其中5836條可注釋到30個不同的病毒科（包括細小病毒科中的細小病毒亞科和濃核病毒亞科），包括10種脊

5、椎動物病毒（占52％）、6種昆蟲病毒（占8.1％）、7種植物病毒（占12.6％）、其他病毒（占27.3％）。基因序列與遺傳進化分析表明旱獺糞便標本中存在新型的甲肝病毒，對新型的甲肝病毒(WHAV)進行深入分析顯示，該病毒基因組全長為7566 bp，編碼一個長度為2252個氨基酸組成的完整多聚蛋白，該病毒與已知肝炎病毒屬中的甲型肝炎病毒具有67％的氨基酸同源性。基因特點與進化分析顯示，該病毒可能是小RNA病毒科肝炎病毒屬的一個新的種。對該