版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請進行舉報或認領(lǐng)
文檔簡介
1、豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)是豬鼻腔的常在菌,除了在自然條件下可引起豬的肺炎,近年來被發(fā)現(xiàn)其與人胃癌、大腸癌有高度相關(guān)性,已經(jīng)被認為是一種新發(fā)人傳染病的病原。由于缺乏簡單、快速的檢測方法,該病原在人群中的感染情況尚不清楚。因此,該病原檢測方法的研究將是流行病學研究的關(guān)鍵。
血清學檢測方法以其靈敏度高、簡便快捷及費用相對低廉等各種優(yōu)點已經(jīng)廣泛用于病原微生物感染的實驗室診斷,尤其是直接血清學方法對于因
2、帶菌量少、血清抗體滴度較低的感染檢測具有較大的優(yōu)勢。因此,本研究從單克隆抗體研制著手,進而建立以檢測抗原為目的的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定試驗法(ELISA),以期發(fā)展一種特異、敏感和快速的人豬鼻支原體感染的檢測方法。為此,我們從以下幾個方面進行了研究。
首先,單抗的制備與鑒定。使用豬鼻支原體CVCC361(購自中國獸藥監(jiān)察所)株全菌抗原免疫BALB/c小鼠,經(jīng)細胞融合,用ELISA法篩選獲得.ZB1~ZB17共17個陽性
3、雜交瘤細胞株,其分泌抗體的效價最高達1:1.28×105以上,并與實驗動物常見的7種病原菌及11種支原體呈陰性反應(yīng);IgG亞類分別為IgG1、IgG2、IgG2b、IgG3;免疫印跡試驗顯示,ZB1、ZB2及ZB16與相對分子質(zhì)量為35×103的抗原有特異性結(jié)合,而ZB3和ZB10與相對分子質(zhì)量為70×103的抗原有特異性結(jié)合。
其次,我們建立了以單抗為診斷抗體的雙抗體夾心ELISA法。采用最佳配對實驗,篩選出以單抗ZB1
4、作為包被抗體、ZB1、ZB2—辣根過氧化物酶標記(ZB1—HRP、ZB2—HRP)作為檢測抗體的配對,對豬鼻支原體抗原的檢測限均可達到ng級水平,可檢出最小抗原量為3.9ng/ML,檢出豬鼻支原體活菌8.34×102CFU/mL,與人呼吸道常見的致病微生物及11種支原體均無非特異性反應(yīng)。
綜上所述,本研究采用B淋巴細胞雜交瘤細胞技術(shù)成功地制備出了17株較高特異性和敏感性的抗豬鼻支原體單克隆抗體,并以其為診斷抗體建立起以檢測
5、抗原為目的的雙抗體夾心ELISA法,顯示了較好的特異性和敏感性。為人群豬鼻支原體流行病學研究提供了一種更可靠而便利的手段,并將對這一新發(fā)感染性疾病的研究,進而對人類腫瘤防控有重要的意義。
念珠狀鏈桿菌是一種革蘭陰性,多形態(tài)細菌,可引起人鼠咬熱及哈佛山熱,其正常宿主為嚙齒類動物,對人類、實驗小鼠、非人靈長類等有極強的致病性,已經(jīng)被認為是動物試驗工作者的職業(yè)危害、是各國實驗動物必需排除的致病菌,也被世界衛(wèi)生組織列為人類新發(fā)傳染
6、病的病原菌。
該病原菌細胞的形態(tài)和排列因環(huán)境條件及菌齡不同而差別極大,具有自動形成和保持L型的能力,對鏈霉素、青霉素、四環(huán)素較敏感。體外培養(yǎng)營養(yǎng)要求高,生長緩慢。
由于念珠狀鏈桿菌特殊的生物學特性,決定了其在實驗動物質(zhì)量常規(guī)檢測和人感染的實驗室診斷的困難性。病原學方法可能因該菌的變異性、特殊營養(yǎng)要求、生長緩慢、帶菌量少、形態(tài)變異等特性而呈陰性結(jié)果;分子生物學方法對該菌的檢測尚處于探索階段,在用于實驗動物常規(guī)檢
7、測時,沒有商品化的檢測試劑盒,難以確保檢測質(zhì)量,此外,檢測成本也是限制該方法的一個重要因素;由于該菌在人和實驗小鼠感染后潛伏期短,發(fā)病急,間接血清學檢測方法也不適用。因此發(fā)展以檢測病原為目的的直接血清學方法具有十分重要的意義。
本研究利用單克隆抗體技術(shù),制備抗念珠狀鏈桿菌的特異性單抗,進而建立雙抗體夾心ELISA法,以期建立一種快速、高特異性、高敏感性和低成本的實驗動物質(zhì)量常規(guī)檢測方法和人類念珠狀鏈桿菌感染的實驗室診斷方法
8、,并為進一步的病原學、流行病學研究提供技術(shù)儲備。為此,我們從以下幾個方面進行了研究。
首先,對念珠狀鏈桿菌的變異性進行了觀察,以確定免疫原。對不同培養(yǎng)條件及培養(yǎng)時間的念珠狀鏈桿菌進行了動態(tài)觀察,發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)時間及液體培養(yǎng)環(huán)境與固體培養(yǎng)基上菌體形態(tài)有明顯差異,電鏡結(jié)果顯示了細胞結(jié)構(gòu)的變化,鏈狀形態(tài)的細菌有細胞壁缺失及膜成分的增厚。結(jié)果表明,48h液體培養(yǎng)物既有較典型的原型結(jié)構(gòu)也有變異型,適宜作為免疫原免疫動物。
9、 其次,單抗的制備與鑒定。選用48h液體培養(yǎng)物對BALB/c小鼠進行免疫,ELISA法篩選獲得SM1~SM16共16個陽性雜交瘤細胞株,其分泌抗體的效價最高達1:1×105;IgG亞類分別為IgG1、IgG2a;免疫印跡試驗顯示,SM6、SM7和SM8與念珠狀鏈桿菌在50×103相對分子質(zhì)量處有反應(yīng)條帶,SM9在35×103相對分子質(zhì)量處有反應(yīng)條帶。與不同形態(tài)的培養(yǎng)物的免疫印跡試驗顯示,SM9與肉湯及平皿培養(yǎng)物在35×103相對分子質(zhì)量
10、處均有一條反應(yīng)條帶,SM6、SM7和SM8僅與平皿培養(yǎng)物在50×103相對分子質(zhì)量處有反應(yīng)條帶;免疫熒光結(jié)果顯示,SM9與桿狀菌體反應(yīng)較鏈狀菌體強烈,SM6、SM7和SM8則相反;同時,免疫電鏡結(jié)果顯示SM9主要與細胞壁發(fā)生反應(yīng),而SM6、SM7和SM8的反應(yīng)主要發(fā)生在細胞膜上。
進而,我們建立了雙抗體夾心ELISA法。最佳配對實驗篩選出SM9—SM6—HRP的最佳配對,檢測限為125ng/mL,活菌檢測限為12.1×10
11、2CFU/mL。與人呼吸道常見的致病微生物及支原體均無非特異性反應(yīng)。可有效的檢測L型變異菌,檢測靈敏度與非變異菌無顯著差別。
綜上所述,本研究采用B淋巴細胞雜交瘤細胞技術(shù)成功地制備出了16株抗念珠狀鏈桿菌單克隆抗體,通過ELISA法、免疫印染法和免疫電鏡方法確定了其特異性、敏感性、所結(jié)合抗原的相對分子質(zhì)量,以及和菌體細胞的免疫結(jié)合點,以此為基礎(chǔ)建立了較高特異性和敏感性的雙抗體夾心ELISA法,并能有效地檢出L型變異菌。
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 牛支原體單克隆抗體的制備及其雙抗夾心ELISA檢測方法的建立.pdf
- hGH單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA檢測法的建立.pdf
- 抗cetuximab單克隆抗體制備及其雙抗體夾心elisa檢測方法的建立
- 抗PEDV單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA方法的建立.pdf
- (一)豬鼻支原體免疫膠體金快速檢測卡的研制;(二)抗念珠狀鏈桿菌單克隆抗體的制備和鑒定.pdf
- 抗DR5單克隆抗體的研制及其定量雙抗體夾心ELISA方法的建立.pdf
- 豬圓環(huán)病毒2型單克隆抗體研制與夾心ELISA抗原檢測方法的建立.pdf
- 抗豬輪狀病毒單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA檢測方法的初步建立.pdf
- 豬偽狂犬病毒單克隆抗體的研制及雙抗體夾心ELISA檢測病毒方法的建立.pdf
- 流產(chǎn)衣原體MIP蛋白的雙抗原夾心ELISA診斷方法建立及單克隆抗體制備.pdf
- 抗雞IL-4單克隆抗體的研制及其雙抗體夾心ELISA方法的初步建立.pdf
- 抗GNA兔單克隆抗體的制備及其夾心ELISA檢測體系的建立.pdf
- 孔雀石綠單克隆抗體的研制及ELISA檢測方法的建立.pdf
- 抗人ARMET單克隆抗體的制備及ELISA檢測方法的建立.pdf
- 兔支氣管敗血波氏桿菌單克隆抗體的制備及雙夾心ELISA檢測方法的建立.pdf
- 雙單克隆抗體夾心ELISA檢測IFN-α方案建立及臨床應(yīng)用的探討.pdf
- 化膿隱秘桿菌溶血素Domain 4單克隆抗體的制備及雙抗體夾心ELISA方法的建立.pdf
- 抗s.paratyphiao2抗原單克隆抗體制備及elisa檢測方法的建立
- 鵝細小病毒單克隆抗體的制備及單抗雙夾心ELISA檢測方法的建立.pdf
- 牛IFN-γ單克隆抗體的研制與抗體夾心ELISA檢測牛結(jié)核方法的建立及初步應(yīng)用.pdf
評論
0/150
提交評論