中藥超微飲片與傳統(tǒng)飲片化學(xué)成分及藥效學(xué)劑量對比研究.pdf

1、1、目的與意義
　　 中藥飲片的應(yīng)用已有數(shù)千年的歷史,為保障人民健康做出了重大貢獻。但隨著科學(xué)技術(shù)的進步,人民群眾生活水平的提高,中藥飲片煎煮麻煩、服用不便、質(zhì)量不穩(wěn)定、衛(wèi)生狀況差等缺點嚴重制約了中醫(yī)臨床的發(fā)展。20世紀90年代,超微粉碎技術(shù)成功應(yīng)用于中藥材加工,它以細胞破壁為目的,現(xiàn)已對400多種常用中藥材制備成中藥超微飲片。中藥材經(jīng)超微粉碎后,有利于藥物有效成分的溶出,提高了藥效,從而可以減少藥材用量。由于細胞破壁后有效成分

2、的快速大量釋出,超微飲片欲應(yīng)用于臨床,必須要重新確定其使用劑量。目前,超微飲片臨床用量與療效關(guān)系研究不夠明確。而中藥復(fù)方是臨床治療疾病的主要形式,故對中藥復(fù)方超微飲片的量效關(guān)系研究更有意義。基于以上目的,本項目選取小柴胡湯、葛根芩連湯2個經(jīng)典復(fù)方為代表,對其超微飲片與傳統(tǒng)飲片從化學(xué)成分及藥效學(xué)兩方面進行對比研究,為中藥超微飲片替代傳統(tǒng)飲片應(yīng)用于臨床提供科學(xué)依據(jù)。
　　 2、實驗方法
　　 2.1 超微飲片與傳統(tǒng)飲片化學(xué)成

3、分對比研究
　　 取超微飲片各樣品少許,制成臨時水裝片,顯微鏡下測量粒徑大小并觀察細胞破壁情況。采用薄層色譜法對小柴胡湯黃芩苷成分及葛根芩連湯葛根素、鹽酸小檗堿及黃芩苷3種化學(xué)成分進行定性鑒別；測定并比較超微飲片與傳統(tǒng)飲片水溶性浸出物重量。
　　 采用紫外分光光度法測定不同溶劑量(5倍,10倍,20倍)小柴胡湯總黃酮及葛根芩連湯黃連總生物堿溶出量(mg·g-1)并作比較；比較相同溶劑量(20倍)、不同浸泡(或煎煮)時間總

4、黃酮及黃連總生物堿溶出量。采用高效液相色譜法(HPLC)測定小柴胡湯中黃芩苷、葛根芩連湯中葛根素溶出量并作比較；測定相同溶劑量、不同浸泡(或煎煮)時間黃芩苷及葛根素溶出量并作比較。
　　 2.2超微飲片與傳統(tǒng)飲片藥效學(xué)劑量對比研究
　　 采用小鼠免疫性肝損傷模型觀察小柴胡湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片對小鼠肝臟、脾臟、胸腺臟器指數(shù),血清ALT與AST活性及肝臟病理改變的影響；采用MTT比色法觀察兩種飲片對免疫性肝損傷小鼠脾淋巴細胞

5、增殖的影響,比較超微飲片與傳統(tǒng)飲片藥效學(xué)劑量相關(guān)性。采用小鼠小腸炭末推進實驗與體外抑菌實驗比較葛根芩連湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片藥效學(xué)劑量相關(guān)性。
　　 3、實驗結(jié)果
　　 3.1 超微飲片與傳統(tǒng)飲片化學(xué)成分定性定量分析結(jié)果
　　 3.1.1超微飲片粒度檢測
　　 顯微鏡下可見超微飲片破壁細胞占視野的95％以上,顆粒直徑一般2～30μm。除個別石細胞、木纖維等可見完整細胞外,其余均無完整細胞。
　　 3

6、.1.2超微飲片與傳統(tǒng)飲片薄層色譜鑒別
　　 在相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)對照品相同位置上,超微飲片、傳統(tǒng)飲片均出現(xiàn)相同斑點,且超微飲片較傳統(tǒng)飲片斑點更明顯；陰性對照品相同位置未見斑點。實驗結(jié)果提示,中藥材經(jīng)超微粉碎后化學(xué)成分沒有改變,保持了原藥材藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 3.1.3 超微飲片與傳統(tǒng)飲片水溶性浸出物量比較
　　 在相同條件下,小柴胡湯超微飲片的水溶性成分溶出量顯著多于傳統(tǒng)飲片(P<0.01),約為傳統(tǒng)飲片的2倍；葛根

7、芩連湯超微飲片水溶性浸出物是傳統(tǒng)飲片的1.5倍。實驗結(jié)果表明,中藥材經(jīng)超微粉碎后,可以增加水溶性成分的溶出量,從而顯著地提高了浸膏得率。
　　 3.1.4小柴胡湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片總黃酮、黃芩苷溶出量測定
　　 在相同溶劑量條件下,超微飲片總黃酮、黃芩苷溶出量顯著大于傳統(tǒng)飲片(P<0.01),約是傳統(tǒng)飲片的1.5～2倍；且有效成分溶出量隨溶劑量的增多而增多。20倍溶劑量條件下,有效成分溶出最多。
　　 3.1.5

8、小柴胡湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片總黃酮、黃芩苷溶出速度比較
　　 實驗結(jié)果表明,在相同溶劑量條件下,浸泡(或煎煮)不同時間,超微飲片中總黃酮、黃芩苷的溶出量顯著多于傳統(tǒng)飲片,兩者比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；超微飲片組內(nèi)比較,浸泡不同時間總黃酮、黃芩苷溶出量無顯著性差異(P>0.7),提示超微飲片有效成分在短時間內(nèi)可快速溶出。傳統(tǒng)飲片總黃酮、黃芩苷溶出量與煎煮時間呈正相關(guān),在60min時溶出最多。實驗結(jié)果提示,藥材經(jīng)超微粉碎后細胞

9、破壁,細胞內(nèi)有效成分溶出速率顯著加快。
　　 3.1.6葛根芩連湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片中黃連總生物堿、葛根素溶出量比較
　　 實驗結(jié)果表明,在相同條件下,葛根芩連湯超微飲片中黃連總生物堿的溶出量是傳統(tǒng)飲片的1.74倍；葛根素溶出量是傳統(tǒng)飲片的1.37倍。實驗結(jié)果表明,中藥材經(jīng)超微粉碎后,有效成分溶出量增加。
　　 3.2超微飲片與傳統(tǒng)飲片藥效學(xué)劑量相關(guān)性
　　 3.2.1小柴胡湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片藥效學(xué)劑量

10、相關(guān)性研究
　　 在小鼠免疫性肝損傷實驗?zāi)Ｐ蜕?模型組ALT、AST活性顯著升高,統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明與空白對照組比較有顯著性差異(P<0.05)。聯(lián)苯雙酯組,超微飲片與傳統(tǒng)飲片1、2組均可顯著降低免疫性肝損傷小鼠血清ALT活性(P<0.05)；超微飲片1、2組與傳統(tǒng)飲片1組均可降低血清AST活性,與模型對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)苯雙酯組對降低血清AST活性不顯著。對實驗數(shù)據(jù)進行分析可知,在降低血清轉(zhuǎn)氨酶活性方面,超微

11、飲片最低有效劑量是傳統(tǒng)飲片的1/4倍。聯(lián)苯雙酯組、超微飲片1組與傳統(tǒng)飲片1組均可減輕肝臟病理損傷程度,與模型對照組相比有顯著性差異(P<0.05),提示小柴胡湯對肝臟損傷具有保護作用。在改善肝臟病理方面,超微飲片最低有效劑量是傳統(tǒng)飲片的1/2倍。與空白對照組比較,模型對照組脾臟指數(shù)有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),表明免疫性肝損傷小鼠脾臟增大、腫脹明顯；肝臟及胸腺指數(shù)沒有顯著改變。實驗結(jié)果表明,各給藥組對肝、脾、胸腺臟器指數(shù)影響不顯著。

12、r>　　 在脾淋巴細胞增殖實驗中,超微飲片與傳統(tǒng)飲片1、2組均可抑制脾淋巴細胞增殖,與模型對照組相比有顯著性差異(P<0.05)。聯(lián)苯雙酯組對淋巴細胞增殖影響不顯著。對超微飲片與傳統(tǒng)飲片劑量進行分析可知,在抑制淋巴細胞增殖方面,超微飲片最低有效劑量是傳統(tǒng)飲片的1/2倍。
　　 3.2.2葛根芩連湯超微飲片與傳統(tǒng)飲片藥效學(xué)劑量對比研究
　　 在小腸炭末推進實驗中,與空白對照組相比較,黃連素組、超微飲片1～4組及傳統(tǒng)飲片1

13、組均能降低正常小鼠小腸炭末推進率,統(tǒng)計學(xué)結(jié)果表明有顯著性差異(P<0.05),提示藥物通過抑制小腸的蠕動起到止瀉作用；小腸炭末推進實驗數(shù)據(jù)表明,超微飲片最低有效劑量是傳統(tǒng)飲片的1/16倍。在體外抑菌實驗中,阿莫西林組、超微飲片1組與傳統(tǒng)飲片1組均能抑制金黃色葡萄球菌、福氏痢疾桿菌及志賀痢疾桿菌的生長,與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。對實驗數(shù)據(jù)分析可知,在相同劑量下,超微飲片抑菌作用優(yōu)于傳統(tǒng)飲片；體外抑菌實驗數(shù)據(jù)表明,超微飲

14、片最低有效抑菌劑量是傳統(tǒng)飲片的1/2倍。
　　 4、研究結(jié)論
　　 4.1因中藥材質(zhì)地各異,經(jīng)超微粉碎后,細胞破壁率一般可達90％以上。顯微鏡下可見絕大部分為顆粒狀物質(zhì),平均粒徑在2～30μm,個別大的團塊直徑達100μm。除極個別石細胞、木纖維等可見完整細胞外,其余均無完整細胞形態(tài)。4.2中藥超微飲片保持了中藥材固有的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。中藥材經(jīng)超微粉碎細胞破壁后,粒徑雖然達到微米級,但其細化程度尚不涉及原子或分子結(jié)構(gòu)層面

15、的變化,因此保持了中藥材固有的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。薄層色譜鑒別實驗結(jié)果可見,超微飲片與傳統(tǒng)飲片均顯示出相同位置、相同性質(zhì)的斑點,提示兩種飲片中化學(xué)成分一致,超微粉碎不會改變藥材的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 4.3中藥超微飲片有效成分溶出量顯著增加,溶出速率顯著加快。中草藥的主要有效成分通常分布于細胞內(nèi)與細胞間質(zhì),且以細胞內(nèi)為主。與傳統(tǒng)飲片相比,中藥超微飲片細胞破壁后,細胞內(nèi)有效成分不經(jīng)過細胞膜阻擋而直接溶出,有效化學(xué)成分溶出量約為傳統(tǒng)飲

16、片的2倍。中藥超微飲片不需煎煮,開水浸泡10min有效成分即可大量溶出。
　　 4.4藥效學(xué)研究結(jié)果提示,中藥超微飲片應(yīng)用于臨床,可以顯著減少藥材使用量,但不同方劑、不同觀察指標(biāo)的選擇可能影響兩種飲片的量效關(guān)系。在小柴胡湯對小鼠免疫性肝損傷實驗中,超微飲片是傳統(tǒng)飲片的1/4劑量即可顯著降低ALT活性水平,而超微飲片是傳統(tǒng)飲片的1/2劑量時才能改善AST活性水平及肝臟病理損傷；在葛根芩連湯對小鼠小腸炭末推進的實驗中,超微飲片是傳統(tǒng)