一種新型c-Mpl突變體的克隆及功能研究.pdf

1、血小板生成素(thrombopoietin,TPO)是調(diào)節(jié)血小板生成最主要的細胞因子,它的生物學效應由其受體c-Mpl介導。c-Mpl與TPO結合后,c-Mpl形成同源二聚體,激活JAK/STAT、Shc/Ras/MAPK、PI3K/Akt等信號通路,產(chǎn)生一系列的生理效應,包括刺激正常造血祖細胞的增值分化,巨核細胞成熟和血小板的產(chǎn)生等,因而c-Mpl的研究對于在臨床上治療由于血小板減少而引發(fā)的各類疾病中具有重要的應用價值。
　　

2、 本研究以在人體巨核細胞白血病株Dami細胞中發(fā)現(xiàn)的一個在c-mpl胞外段近膜區(qū)的胞外細胞因子受體同源結構域CRM2區(qū)中缺失了72bp(c-Mpl-del72)的自發(fā)突變?yōu)檠芯繉ο?。該缺失突變與CRM2中的保守氨基酸WSXWS相距12個氨基酸,造成胞外區(qū)缺失24個氨基酸,但未引起c-mpl基因編碼序列讀碼框的改變。本文成功構建了表達野生型c—Mpl的真核表達載體pEGFP-N1/mpl—ful以及表達缺失24個氨基酸的c-Mp-del的

3、pEGFP-N1/mpl-del,將兩個載體分別成功的轉入了NIH3T3細胞中,通過G418篩選得到了可以表達c-Mp-wt以及c-Mpl-del72蛋白的穩(wěn)定表達細胞系。通過對上述細胞系的研究,發(fā)現(xiàn)c-Mp—wt以及c-Mpl-del72在細胞上的表達有著顯著差異,且在誘導細胞多核化以及對細胞周期的影響方面也有著顯著的不同。另外本文利用.BiFC-雙分子熒光互作系統(tǒng),分別構建了可以表達野生型c-Mp-wt胞外段和突變c-Mpl-del

4、72胞外段的pBiFC—VN173/mpl-ful,pBiFC-VN173/mpl—del72,以及表達TPO的pHA—vc155/TP。將pBiFC-VN173/mpl-ful和pHA—vc155/TPO以及pHA—vc155/TPO pBiFC-VN173/mpl-del72共轉染COS7細胞,利用BiFC研究野生型c-Mpl和突變型c-Mpl與TPO相互作用的強弱。本研究發(fā)現(xiàn)的c-Mpl-del72是在人巨核細胞白血病細胞株Dam