抑制纖維連接蛋白的合成誘導(dǎo)大鼠系膜細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究.pdf

1、目的：腎小球硬化和/或間質(zhì)纖維化是腎臟疾病走向終末期腎功能衰竭的最終途徑。腎臟纖維化過程中普遍存在著細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度積聚和細(xì)胞增殖。纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)是ECM重要成分之一，在細(xì)胞粘附、移動、增殖等方面起著極其重要的作用。在大多數(shù)腎小球硬化及間質(zhì)纖維化中都可觀察到FN的過度積聚。本研究目的在于，利用RNAi(RNAinterference)技術(shù)，直接抑制內(nèi)源性FN的合成。觀察FN的缺失對大鼠腎臟系膜細(xì)胞

2、增殖與凋亡的影響。進(jìn)而闡明凋亡的途徑以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子的異常在凋亡中的作用。 方法：分離并培養(yǎng)大鼠原代腎小球系膜細(xì)胞。體外合成siRNA(smallinterferenceRNA)，選取抑制效果最佳的片段。構(gòu)建表達(dá)shRNA(smallhairinRNA)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，穩(wěn)定抑制大鼠系膜細(xì)胞FN的表達(dá)。應(yīng)用實時定量PCR、Westernblot、細(xì)胞免疫熒光檢測FN的表達(dá)水平。應(yīng)用JC-1染色檢測線粒體功能。流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測凋

3、亡細(xì)胞數(shù)量。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入環(huán)孢霉素A、外源性FN以及caspase3、8的阻斷劑，判定細(xì)胞凋亡的途徑。利用共聚集顯微鏡檢測應(yīng)激條件下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)InsP3(1,4,5-triphosphatereceptor)受體及RyR(Ryanodinereceptor)鈣通道的開放情況。在誘導(dǎo)凋亡過程中加入L型鈣通道阻斷劑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣InsP3受體及RyR鈣通道阻斷劑，確定鈣離子在FN缺失導(dǎo)致凋亡中的作用。 結(jié)果：合成的siRNA及逆轉(zhuǎn)錄病

4、毒載體所表達(dá)的shRNA都可以有效地抑制系膜細(xì)胞FN的合成，而且長時間的抑制會導(dǎo)致系膜細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。FN缺失后出現(xiàn)的細(xì)胞凋亡過程中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性凋亡途徑的主要成分細(xì)胞色素c釋放、caspase9和caspase3的激活；而外源性凋亡途徑的最主要成分caspase8的表達(dá)沒有明顯變化，并且caspase8被特異阻斷后，不影響FN缺失誘發(fā)的細(xì)胞凋亡。該結(jié)果提示內(nèi)源性凋亡途徑的啟動是FN缺失后細(xì)胞凋亡的原因，而外源性凋亡途徑在此凋亡中不起主要作

5、用。進(jìn)一步對凋亡啟動機(jī)制的研究中，發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)InsP3受體及RyR鈣通道在應(yīng)激條件下，對胞漿鈣的升高起著不同的作用。在FN缺失后的細(xì)胞凋亡中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)InsP3鈣通道開放導(dǎo)致的胞漿鈣離子增加是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要原因。 結(jié)論：①RNAi方法是有效的基因抑制工具。本研究所構(gòu)建的以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體為基礎(chǔ)的shRNA表達(dá)系統(tǒng)，為基因的功能研究和臨床治療提供了新的方法。②FN的缺失可以誘導(dǎo)系膜細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)源性途徑的凋亡。③細(xì)胞外基質(zhì)成分的改變，