單通道雙酶同步測(cè)定及其免疫分析應(yīng)用.pdf

1、多酶同步分析可顯著提高檢測(cè)效率。已有的用兩種酶標(biāo)記的單通道測(cè)量?jī)山M分的ELISA技術(shù)，并沒有實(shí)現(xiàn)單通道兩種酶同步反應(yīng)和同步檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)室建立了基于等吸收波長(zhǎng)原理的單通道雙酶同步分析方法（簡(jiǎn)稱SDESA），并將其成功應(yīng)用于ELISA（簡(jiǎn)稱SDESA-ELISA），該方法在同一體系中，同時(shí)啟動(dòng)并同步監(jiān)測(cè)所有標(biāo)記酶的反應(yīng)。SDESA的技術(shù)關(guān)鍵在于選擇一對(duì)合適的顯色底物和一對(duì)合適的標(biāo)記酶，并建立消除吸收重疊干擾和混合體系中物質(zhì)干擾的數(shù)據(jù)處理方法

2、，從而使SDESA-ELISA的檢測(cè)限、靈敏度及線性范圍與單組份ELISA相當(dāng)。為解決上述問題，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)SDESA進(jìn)行了下列研究:
　　1.復(fù)雜動(dòng)力學(xué)體系雙酶同步測(cè)定-建立消除干擾的數(shù)據(jù)處理方法
　　用于單通道雙酶同步測(cè)定的兩種酶需滿足以下要求:(a)酶A作用于底物A生成產(chǎn)物A，酶B作用于底物B生成產(chǎn)物B。產(chǎn)物A的最大差吸收峰(λA)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于產(chǎn)物B的最大差吸收峰(λB)，且λB在產(chǎn)物A和底物A的最大等吸收波長(zhǎng)(λO)附近。

3、(b)λA和λO處的光吸收值通過快速變換檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行定量，基于吸收的線性加和性消除吸收重疊干擾。(c)通過反應(yīng)曲線動(dòng)力學(xué)分析消除體系中物質(zhì)對(duì)待測(cè)酶的干擾（抑制或激活）。(d)如果底物A的濃度低于其米氏常數(shù)，則選用本實(shí)驗(yàn)室建立的聯(lián)用策略對(duì)酶A進(jìn)行定量。
　　分析γ-谷氨酰基轉(zhuǎn)移酶(GGT)和乳酸脫氫酶(LDH)同步測(cè)定的復(fù)雜動(dòng)力學(xué)過程，并以此作為SDESA的化學(xué)計(jì)量學(xué)模型。GGT作用于γ-谷氨?；?對(duì)硝基苯胺(GGPNA)，釋放出對(duì)

4、硝基苯胺(PNA)，PNA最大差吸收峰λA在405 nm附近，GGPNA和PNA的最大等吸收波長(zhǎng)λO在344 nm; LDH消耗還原態(tài)尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH，還原型輔酶Ⅰ)，NADH的最大差吸收峰λB在340 nm。通過對(duì)反應(yīng)過程的動(dòng)力學(xué)分析，消除了PNA對(duì)LDH的抑制作用;通過聯(lián)用策略測(cè)定的GGT初速度線性范圍以及消除干擾后的LDH線性范圍都與各自單獨(dú)測(cè)定時(shí)的線性范圍相當(dāng);當(dāng)一種酶的活力相當(dāng)于另一種酶的25倍時(shí)，活力較低的酶

5、通過SDESA的定量限仍然與單獨(dú)測(cè)定時(shí)相當(dāng)。
　　2.簡(jiǎn)單動(dòng)力學(xué)體系的雙酶同步測(cè)定及在免疫分析中的應(yīng)用（一）
　　為了探索SDESA的潛在應(yīng)用價(jià)值，牛小腸堿性磷酸酶(ALP)和β-D-半乳糖苷酶(BGAL)被用作酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)的標(biāo)記酶，用于小分子半抗原的單通道同步測(cè)定。ALP作用于4-硝基-1-萘酚磷酸酯(4NNPP)，釋放出4-硝基-1-萘酚(4NNP)，4NNP最大差吸收峰λA在458 nm，4NNPP和

6、4NNP的最大等吸收波長(zhǎng)λO在405 nm;BGAL作用于對(duì)硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(PNPG)，釋放出4-硝基苯酚(4NP)，4NP的最大差吸收峰λB在405 nm。由于不存在底物或產(chǎn)物間的干擾，ALP和BGAL的組合可用于ELISA同步分析單通道內(nèi)的青霉素G和克倫特羅。結(jié)果表明，任意一個(gè)半抗原同步測(cè)定時(shí)的定量限均與單獨(dú)測(cè)定時(shí)基本相當(dāng)，因此，SDESA具有廣闊的應(yīng)用前景;獲得一對(duì)恰當(dāng)?shù)娘@色底物和一對(duì)適當(dāng)?shù)臉?biāo)記酶是其應(yīng)用于ELISA的

7、關(guān)鍵。
　　3.簡(jiǎn)單動(dòng)力學(xué)體系的雙酶同步測(cè)定及在免疫分析中的應(yīng)用（二）
　　通常情況下，糖苷酶之間都具有良好的緩沖液兼容性，且?guī)缀醪淮嬖诘孜锘虍a(chǎn)物的相互干擾。BGAL水解4-硝基-1-萘酚-β-D-半乳糖苷(4NNPG)，釋放出4-硝基-1-萘酚(4NNP)，4NNP最大差吸收峰λA在458 nm左右，4NNPG和4NNP的最大等吸收波長(zhǎng)λO在400 nm;α-D-葡萄糖苷酶(AGLU)作用于對(duì)硝基苯酚-α-D-葡萄糖苷(4

8、NPG)，釋放出4-硝基苯酚(4NP)，4NP的最大差吸收峰λB在400 nm。這種特性使得BGAL和AGLU可作為同步分析ELISA的標(biāo)記酶，通過快速變換檢測(cè)波長(zhǎng)，同時(shí)測(cè)定405 nm和450 nm的吸收。事實(shí)上，用青霉素G標(biāo)記的BGAL和克倫特羅標(biāo)記的AGLU作為示蹤劑的競(jìng)爭(zhēng)性ELISA，單通道內(nèi)青霉素G和克倫特羅同步測(cè)定的結(jié)果都與單獨(dú)測(cè)定的結(jié)果具有良好的一致性，對(duì)于任意一種半抗原，同步測(cè)定的精密度和回收率均與單獨(dú)測(cè)定時(shí)相當(dāng)。因此，

9、對(duì)一個(gè)作用于底物產(chǎn)生4-硝基-1-萘酚的糖苷酶和另一個(gè)作用于底物產(chǎn)生4-硝基苯酚的糖苷酶進(jìn)行分子工程改造以得到比活力足夠高的酶作為一組標(biāo)記酶，可使得同步分析ELISA成為一種可行的、新型的免疫分析平臺(tái)，該平臺(tái)不僅提高了分析效率，而且可獲得令人滿意的靈敏度。
　　4.標(biāo)記酶篩選
　　我們通過以上兩組SDESA-ELISA應(yīng)用實(shí)例得出以下結(jié)論，為獲得良好的檢測(cè)效果，SDESA-ELISA的一對(duì)顯色底物和一對(duì)標(biāo)記酶的選擇需遵循以下

10、幾點(diǎn)原則:(a)一個(gè)顯色底物的最大等吸收波長(zhǎng)應(yīng)該等于或接近405 nm，其產(chǎn)物最大吸收峰在450 nm或490 nm附近，而另一個(gè)顯色底物的產(chǎn)物最大吸收峰應(yīng)在405 nm附近，從而保證在最優(yōu)條件下用傳統(tǒng)光度計(jì)進(jìn)行同步檢測(cè)時(shí)，任意一個(gè)顯色產(chǎn)物的定量靈敏度和LOQ都與各自單獨(dú)測(cè)定時(shí)相當(dāng)。(b)一對(duì)合適的標(biāo)記酶應(yīng)該在相同的緩沖液中對(duì)一對(duì)預(yù)先選定的顯色底物具有足夠高的比活力，且耐受來自SDESA體系中物質(zhì)的干擾，從而簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)處理過程。一般來說，