IL-1受體抗拮劑預(yù)防炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的大鼠胰島無(wú)功能的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：
　　 胰島細(xì)胞分離、純化的結(jié)果是胰島移植成功的關(guān)鍵因素。胰島的數(shù)量和質(zhì)量的缺失取決于一些復(fù)合因素,包括胰島分離過(guò)程中的應(yīng)激和肝中移植部位的微環(huán)境等。胰島移植到肝臟后,非特異性炎癥物質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)將被啟動(dòng),包括血凝途徑激活和巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放促炎癥反應(yīng)細(xì)胞因子(PIC)。我們假定完全阻斷IL-1β和其細(xì)胞受體的結(jié)合能夠在PIC引發(fā)分離的胰島凋亡和壞死方面為胰島提供更完全的保護(hù)。我們研究大鼠胰島培養(yǎng)模型加PIC,以闡明胰島損

2、傷機(jī)制且測(cè)定阻斷IL-1受體拮抗劑(IL-1ra)能否為損傷提供保護(hù)。
　　 材料與方法
　　 一、材料
　　 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要設(shè)備、藥品和試劑
　　 普通級(jí)封閉群wistar大鼠,雌雄,體重250-280g。鼠顯微手術(shù)器械,超凈手術(shù)臺(tái),0.22um除菌濾器,電熱恒溫水浴箱(DHW-600),多功能振蕩器,電子天平,微量加樣器,熒光倒置顯微鏡(Olympus),高速離心機(jī)(TDL-5A),CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(

3、Thermo)；全自動(dòng)化化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(美國(guó)雅培AXSYM)。膠原酶V型,Hank’s液,Ficoll-400,雙硫腙(,DTZ),丫啶橙(AO),溴乙啶(EB)；RPMI-1640培養(yǎng)液,TNF-),IL-1ra,IL-1β； NO和一氧化氮合酶(iNOS)檢測(cè)試劑盒。IFN-γ。
　　 二、方法
　　 (一)大鼠胰島的分離和純化。
　　 1、采用明尼蘇達(dá)大學(xué)改良法分離、純化大鼠胰島。膠原酶V原位灌注胰腺,

4、快速切取,水浴消化。再經(jīng)80目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾、離心。然后采用Ficoll不連續(xù)密度梯度離心純化胰島。
　　 (二)胰島培養(yǎng)及分組
　　 新鮮分離純化的胰島RPMI-1640完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)條件為:37℃,5％二氧化碳,95％空氣。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件隨機(jī)分為四組:A組(空白對(duì)照組)；B組(細(xì)胞因子組)；C組(IL-1ra組)；D組:(IL-1ra+細(xì)胞因子組).
　　 三、觀察指標(biāo)
　　 體外葡萄糖刺

5、激下胰島素釋放試驗(yàn)。丫啶橙/嗅乙啶(AO/EB)熒光染色法顯示胰島細(xì)胞活率。檢測(cè)胰島培養(yǎng)液中NO胰島組織中iNOS水平。
　　 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)以(x)±s表示,使用方差分析和t檢驗(yàn),SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果
　　 一、胰島功能檢測(cè)
　　 胰島素釋放實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,A組的胰島經(jīng)過(guò)24h培養(yǎng)后,胰島素分泌水平較高,胰島功能良好。B組

6、胰島功能嚴(yán)重受損,胰島素分泌量和胰島素釋放指數(shù)(SI)均明顯下降(P<0.01):D組胰島素分泌量和SI均較B組明顯升高(P<0.01)。C組胰島在培養(yǎng)液中單純加入IL-1ra后,胰島素分泌及SI有所升高,但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；
　　 二、胰島活性鑒定
　　 A組和C組胰島經(jīng)AO/EB染色后,倒置顯微鏡下可見大多數(shù)胰島發(fā)出綠色熒光,提示胰島存活良好。而B組的胰島染色見大多數(shù)胰島發(fā)出黃色熒光,提示胰島存活不良

7、,大量死亡。D組胰島大多數(shù)仍保持完整外形,發(fā)出綠色熒光,存活情況明顯好于B組。
　　 三、胰島培養(yǎng)液中NO水平和胰島組織中iNOS活性
　　 A組胰島培養(yǎng)24h后,培養(yǎng)液中NO濃度及胰島組織iNOS活性均比較低。
　　 B組胰培養(yǎng)液中NO濃度和胰島組織iNOS活性都較A組明顯升高(P<0.01),尤其是iNOS活性超過(guò)A組10倍以上； D組胰島組織的iNOS活性較B組受到顯著抑制,NO水平也大大降低(P<0.01

8、),與A組基本在同一水平,差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)； C組胰島iNOS活性及培養(yǎng)液NO濃度雖低于A組和D組,但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
　　 結(jié)論
　　 一.在IL-1β、TNF-α、IFN-γ等細(xì)胞因子的刺激下,胰島組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)可大量表達(dá),催化合成的高濃度NO是β細(xì)胞損傷的效應(yīng)因子。
　　 二.IL-1ra對(duì)胰島保護(hù)作用的機(jī)制可能在于,阻止IL-1β等pic與相關(guān)的