胸苷激酶1(TK1)在乳腺癌中的臨床意義的研究.pdf

1、研究背景：
　　 在女性惡性腫瘤中乳腺癌的發(fā)病率占第一位，其發(fā)病率及死亡率在西方國家中均居女性惡性腫瘤的首位。近十年來，我國乳腺癌的發(fā)病率在有逐年上升和年輕化的趨勢，嚴重危害婦女健康。
　　 在過去幾十年，乳腺癌治療效果已經(jīng)取得了巨大的進步。例如，手術(shù)前新輔助化療，結(jié)合放療、內(nèi)分泌治療及免疫治療等降低了復(fù)發(fā)幾率，提高了生存率和生活質(zhì)量。然而，癌癥的療效仍不理想，特別是對于晚期乳腺癌患者。因此，開發(fā)早期發(fā)現(xiàn)乳腺腫瘤的方法有

2、極高的應(yīng)用價值。在早期發(fā)現(xiàn)乳腺腫瘤方面，我們應(yīng)該把焦點放在發(fā)現(xiàn)癌前病變上。探測到癌前病變并施行微創(chuàng)手術(shù)時一項有效的治療腫瘤策略。在體檢中心應(yīng)用超聲、鉬靶等常規(guī)檢查方法可以發(fā)現(xiàn)乳腺包塊，病理檢查可以區(qū)分良性病變與癌前病變。然而，這樣的檢查不能提示乳腺腫瘤的增值率，因此必須結(jié)合腫瘤擴增指標綜合判斷。
　　 近年來大家關(guān)注乳腺癌方面的研究課題主要集中在乳腺癌的預(yù)后因素上，目前研究的關(guān)注點多認為乳腺癌的預(yù)后與臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組

3、織學(xué)類型、激素受體、腫瘤增殖分數(shù)以及p53，C-erb-2等致癌基因有關(guān)。目前越來越多有關(guān)乳腺癌預(yù)后的標志物也被提出，如表皮生長因子受體[1]、m23基因[2]、E-鈣黏蛋白[3]等。我們感興趣的是在血清中檢測這類異常蛋白升降水平，這樣可以不用通過侵入性方法取樣，來幫助我們評估腫瘤早期發(fā)生、腫瘤全切除后的效果以及疾病復(fù)發(fā)和預(yù)后評估?；谀[瘤細胞增殖標志物的理論基礎(chǔ)是由于腫瘤細胞失去正常細胞生長調(diào)控導(dǎo)致細胞惡性增殖，這一理論引導(dǎo)研究開發(fā)一

4、種準確、無侵害性的血清學(xué)檢驗方法，即在現(xiàn)有儀器可能檢測出腫瘤以前，將可能更早期檢測已有腫瘤疾病或潛在的惡變，將給患者提供更好的治療時機。因此，尋求一種既與腫瘤細胞增殖生長密切相關(guān)的，又可用于血清學(xué)和組織學(xué)的腫瘤細胞增殖標志物標記物是我們一直追求的目標。70年代初，稱為“胚胎腫瘤抗原”CEA的發(fā)現(xiàn)，一度使人們相信，一種腫瘤特異性抗原被發(fā)現(xiàn)了?，F(xiàn)一系列單克隆抗體，如CEA，CA19-9，CA125，CA15-3，由于它們的特異性未達到我們的

5、期望，已在臨床上應(yīng)用仍有爭議(12，13)但是通過對CEA及其它胚胎腫瘤抗原的研究為我們提供了許多有價值有關(guān)血液循環(huán)類腫瘤標記物不同特性的信息。Her2是一新臨床應(yīng)用的乳腺腫瘤蛋白質(zhì)標記物，適用于血清學(xué)和組織學(xué)的檢測已及免疫治療，但Her2基因顯性在乳腺癌中僅僅為25-30％(14)，也限制了應(yīng)用范圍。
　　 胸苷激酶(TK)是DNA補救合成途徑的限速酶，在評估增殖細胞的增殖度中的起重要作用。人類細胞中有兩種TK同工酶，一種位于

6、細胞質(zhì)中稱為TK1，另一種位于線粒體中稱為TK2，TK1是S期特殊酶，其濃度與DNA合成呈正相關(guān)，并隨細胞周的變化而變化[4]。既往研究表明，非增殖細胞的TK1和健康人血清和組織中的TK1，其含量極微或檢測不到，但在惡性腫瘤患者中，TK1酶伴隨著腫瘤細胞數(shù)的急劇增殖而升高。目前國內(nèi)外有很多報道是針對TK1在肺癌、宮頸癌、腸癌[5]等腫瘤中的表達及其與腫瘤危險程度的關(guān)系，均認為TK1的表達與腫瘤惡性程度正相關(guān)并影響腫瘤患者的預(yù)后。目前很多

7、研究除了關(guān)注TKl在腫瘤組織中表達情況外，更多研究對血清TK1濃度及其動態(tài)變化感興趣，并且探索TK1在輔助診斷、療效監(jiān)測、腫瘤篩查及預(yù)后判斷中的作用[6]。
　　 第一部分胸苷激酶TK1在乳腺癌中表達的臨床意義
　　 目的：研究乳腺癌患者、乳腺良性病變患者、健康人群組織中TK1表達及外周血中TK1濃度是否存在差異及其臨床意義。
　　 方法和步驟：
　　 研究對象：
　　 (1)選取乳腺導(dǎo)管增生(U

8、DH)、不典型增生(ADH)、導(dǎo)管原位癌(DCIS)與浸潤性導(dǎo)管癌(IDC)患者研究TK1表達，UDH患者(n=25)，ADH患者(n=22)。正常乳腺組織(n=20)取自UDH患者但與UDH組織分開作為對照。IDC(n=60)患者與DCIS(n=25)，所有患者標本2010-2012年均取自深圳市第二人民醫(yī)院病理科。腫瘤標本病理分期根據(jù)AJCC癌癥分級標準，分級依據(jù)WHO腫瘤分期標準。IDC：分級1級n=12，2級n=34，3級n=1

9、4；分期：Ⅰ期n=23，Ⅱa期n=19，Ⅱb期n=19，Ⅲa期n=2；DCIS：分級：1級n=12，2級n=11，3級n=2；分期：所有患者均為0期。所有的癌前病變ADH診斷均依據(jù)WHO推薦標準。
　　 (2)上述IDC患者標本，首先對標本進行常規(guī)病理分析，分析其組織學(xué)特征，病理及臨床分期包括病理分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。在常規(guī)檢查之后再應(yīng)用免疫組化法檢測乳腺癌組織中相關(guān)標志物表達情況，如ER、PR、p53、C-erbB-2、K

10、i-67及TK1。
　　 (3)本實驗共收集90例外周血樣本，其中乳腺癌患者60例、乳腺良性病變患者20例、健康人10例，應(yīng)用增強發(fā)光.免疫點印染法檢測血清中TK1濃度。參與實驗的患者都簽署了知情同意書。
　　 免疫組化MaxVisonTM法檢測乳腺癌組織中TK1的表達：將組織標本石蠟包埋后進行連續(xù)切片，每片厚度4微米，切好后展開放置于經(jīng)粘片劑APES處理過的載玻片上，置58～60℃烤箱中，烘烤60～120min。用二甲

11、苯將切片脫蠟，用酒精梯度水化切片，用PH=7.4的PBS沖洗切片3次，每次3分鐘。應(yīng)用微波修復(fù)抗原：將切片浸入塑料染色缸中，染色缸裝有PH=6.0的檸檬酸緩沖液，應(yīng)用微波爐加熱檸檬酸緩沖液至沸騰后停止加熱，每次加熱間隔5～10分鐘，共加熱15～20分鐘。將切片放于室溫下自然冷卻，用PBS洗滌3次，每次3分鐘。在每張切片加一滴或50ul的3％的H2O2，室溫下孵育10分鐘，此舉目的是滅活內(nèi)源性過氧化物酶。用PBS沖洗切片3次，每次3分鐘。

12、在切片上滴加一滴一抗TK1，在室溫下孵育60分鐘。用PBS沖洗3次，每次3分鐘。再在切片上滴加二抗，二抗為快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物，在室溫孵育30分鐘。甩PBS沖洗3次，每次3分鐘。DAB顯色：在切片上加顯色試劑盒中A、B、C試劑各1滴，每滴中加0.85ml蒸餾水，充分混勻，放置于室溫下避光顯色3～5min，蒸餾水洗去試劑。用蘇木素輕度復(fù)染切片，用自來水漂洗15min，用酒精梯度脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。處理好的切片在

13、光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)構(gòu)。
　　 血清酶免疫點印跡化學(xué)發(fā)光法檢測：分別將校準品1、校準品2、校準品3點樣到硝酸纖維素膜的A1、A2及A3位置上，每孔3μl；待檢患者血清按順序每孔3μl點在后面的空孔上，將點好樣品的硝酸纖維素膜放在室溫下自然涼干，大約30min。用蒸餾水配制pH為7.6的抗體稀釋液，洗滌液和封閉劑。在反應(yīng)盒內(nèi)首先用配置后的稀釋液洗膜2次，清洗時需要輕輕振蕩搖晃纖維素膜，每次大約1min。清洗過后加入封閉劑，封閉大約30

14、min。將膜放入按1:500稀釋度的TK1-IgY抗體中，在室溫下振蕩搖晃讓抗體與樣本充分反應(yīng)，大約120 min；反應(yīng)結(jié)束后用洗滌液洗滌纖維素膜3次，每次5min。將膜放入按1:500稀釋度的生物素化抗IgY二抗中，在室溫下振蕩搖晃讓抗體與樣本充分反應(yīng)，大約40min；反應(yīng)結(jié)束后用洗滌液洗滌纖維素膜3次，每次5min。將膜放入按1:1500稀釋度的SA-HRP中，在室溫下振蕩搖晃讓抗體與樣本充分反應(yīng)，大約60 min；反應(yīng)結(jié)束后用洗滌

15、液洗滌纖維素膜3次，每次5min。將膜浸入ECL發(fā)光試劑中，反應(yīng)1min；將膜片取出，用吸水紙吸干發(fā)光試劑，同時將膜放入壓膜透明膠片內(nèi)擠干剩余溶液中，重新開始計時5min。將處理好的膜放入化學(xué)發(fā)光成像分析儀，待5min計時結(jié)束后進行分析及拍攝。
　　 結(jié)果：
　　 (1)正常的乳腺組織TK1染色為陰性或弱陽性。在UDH中，只有少數(shù)細胞染色，染色部位位于細胞漿。從DCIS至IDC患者，TK1染色逐漸加深。大部分TK1染色位

16、于細胞漿中，只有小部分TK1染色位于細胞核內(nèi)。
　　 (2)在乳腺癌患者中，TKl的陽性表達率為85％(51/60)，TK1表達與年齡、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)不明顯，差異無顯著性，而與組織學(xué)分級、腫塊大小、TNM分期成明顯相關(guān)，差異有顯著性(P均<0.05)。
　　 (3)TK1是在細胞水平表達，因此，腫瘤細胞中染色的數(shù)目可以使我們準確的了解不同腫瘤組織中TK1的表達情況。正常乳腺組織中TK1不表達或表達低于5％，UD

17、H中TK1表達明顯升高為3.3±1.4％，ADH中TK1的表達為8.6±2.8％，兩者有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)。DCIS中TK1的表達明顯升高20±14％，IDC中更是高達29.1±21.4％。在本組實驗對象中，80-90%的ADH、DCIS及IDC患者TK1表達高于5％，而UDH患者中，只有10％患者TK1表達高于5％。
　　 (4)在DCIS與IDC患者中，TK1的表達從Ⅰ級到Ⅲ級逐漸升高。在IDC患者中，盡管不同

18、分期之間TK1的表達有重疊，大體上也與腫瘤的分期成正相關(guān)。TK1表達的均值Ⅰ期與Ⅱa期(P=0.029)，Ⅰ期與Ⅱb期及Ⅲa期(P<0.001)，Ⅱa與Ⅱb期(P=0.196)。腫瘤直徑>3cm的患者TK1表達明顯升高(P<0.001)。
　　 (5)ADH、DCIS與IDC患者的平均年齡分別為40.6±8.1，45.3±5.6，50.3±13歲，UDH患者的平均年齡為43.5±7.7歲。
　　 (6)外周血中血清TK1

19、濃度在乳腺癌患者、乳腺良性病變患者及正常人中表達不同，差異有顯著性，不同級別乳腺癌患者外周血中血清TK1濃度表達也不同，差異有顯著性，即乳腺病變惡性程度越高，患者外周血中血清TK1濃度也相應(yīng)升高。
　　 結(jié)論：
　　 (1)在不同組織學(xué)分級及TNM分期的乳腺癌中，TK1的表達存在差異，組織學(xué)分級及TNM分期升高，TK1的表達也相應(yīng)升高，TK1是反應(yīng)乳腺癌細胞增殖的一個敏感的標準。
　　 (2)在乳腺癌的預(yù)后因素中

20、，高濃度的TK1與高分級的組織病理學(xué)表現(xiàn)可以作為預(yù)測乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的危險因素。
　　 (3)在正常人、乳腺良性病變、由低至高的組織學(xué)分級的乳腺癌中，血清TK1濃度逐漸升高，由此得出結(jié)論通過檢查外周血血清TK1可以作為診斷乳腺癌病變的一個指標。
　　 第二部分血清中胸苷激酶TK1在乳腺癌新輔助化療中的臨床意義及功能
　　 目的：
　　 (1)探討局部晚期乳腺癌患者新輔助化療前后外周血TK1含量的變化。

21、>　　 (2)探討外周血TK1含量的變化對乳腺癌患者預(yù)后的意義。
　　 方法和步驟：
　　 研究對象：
　　 選取2010年10月-2012年3月深圳市第二人民醫(yī)院乳腺外科就診的48例局部晚期乳腺癌患者，其中不包括炎性乳腺癌患者。所有的患者都進行標準的新輔助化療，大部分患者接受了4個療程的環(huán)磷酰胺+表柔吡星序貫4個療程的多西他賽。手術(shù)方式包括乳腺癌改良根治術(shù)或保乳手術(shù)。術(shù)后按照乳腺癌治療指南行輔助腋窩放療、內(nèi)分

22、泌治療或分子靶向治療。隨訪包括術(shù)后第一年每三個月進行一次詢問病史及體檢，第二年每六個月進行一次，以后每年體檢一次。檢查項目包括胸部X片、鉬靶、血常規(guī)及肝功能等常規(guī)檢查，其它附加的檢查要依據(jù)患者的病史或檢查結(jié)果。所有的數(shù)據(jù)整理記錄，包括確診時年齡、腫瘤分期、治療方案、隨訪配合、研究終止點。研究終止點設(shè)定為腫瘤復(fù)發(fā)或與腫瘤相關(guān)的死亡。按以下時間點采集血清標本：新輔助化療前，每次新輔助化療后，手術(shù)后，每次輔助化療后，輔助化療后第3、6、12、

23、24個月。因為統(tǒng)計學(xué)原因，48名患者采取新輔助化療前、手術(shù)前、手術(shù)后輔助化療前及輔助化療后3個月4個時間點進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。
　　 血清酶免疫點印跡化學(xué)發(fā)光法檢測：用蒸餾水配制pH為7.6的抗體稀釋液，洗滌液和封閉劑。將校準品1、校準品2、校準品3點樣到硝酸纖維素膜的A1、A2及A3位置上，每孔3μl；待檢患者血清按順序每孔3μl點在后面的空孔上，室溫下自然涼干，30min。在反應(yīng)盒內(nèi)用配置后的稀釋液振搖洗膜2次，每次1min。加入

24、封閉劑，封閉30min。按1:500稀釋度加入TK1-IgY抗體，室溫下振搖反應(yīng)120 min；棄去反應(yīng)液后用洗滌液振搖洗滌3次，每次5min。按1:500稀釋度加入生物素化抗IgY二抗，室溫下振搖反應(yīng)40min；棄去反應(yīng)液后用洗滌液振搖洗滌3次，每次5min。按1:1500稀釋度加入SA-HRP，室溫下振搖反應(yīng)60 min；棄去反應(yīng)液后用洗滌液振搖洗滌3次，每次5min。加ECL發(fā)光試劑，過膜浸濕，精確反應(yīng)1min后將膜片用吸水紙吸干

25、，重新計時5min，同時將膜放入壓膜透明膠片內(nèi)擠干剩余溶液。將膜放入化學(xué)發(fā)光成像分析儀內(nèi)，待5min計時結(jié)束后進行拍攝及分析。
　　 HER-2的檢測應(yīng)用FISH方法檢測HER-2≥2定義為陽性。
　　 雌激素與孕激素受體水平檢測雌激素與孕激素受體水平檢測應(yīng)用免疫組化法?；钚?10％定義為陽性。
　　 統(tǒng)計分析統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS軟件。S-TK1，腫瘤大小，腫瘤分級，HER-2，淋巴結(jié)狀態(tài)，ER與PR等應(yīng)用t檢驗

26、，卡方分析，Spearman相關(guān)分析。生存分析應(yīng)用Kaplan-Meier法，P≤0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 (1)本實驗共有48名患者參與，確診的平均年齡為49歲，平均隨訪的時間為28個月。由于是局部晚期乳腺癌，大部分(46名)患者接受了改良根治術(shù)。共有22名患者出現(xiàn)了腫瘤的復(fù)發(fā)，其中18名(81.8％)患者出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。由于我們所檢測的乳腺癌標本S-TK1濃度有波動，根據(jù)既往的研究結(jié)果，我們將S-TK

27、1濃度2.0定為臨界值?；颊叻譃?組：S-TK1低表達組(<2.0PM，n=19)及S-TK1高表達組(>2.0PM，n=29)。
　　 (2)通過本研究注意到，血清中S-TK1高的患者較血清中S-TK1低的患者有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險及癌癥相關(guān)的死亡。盡管高S-TK1濃度似乎可以作為預(yù)后指標，但我們必須評價S-TK1是否是淋巴結(jié)狀態(tài)的協(xié)變量，換句話，即高S-TK1水平是否可以替代陽性淋巴結(jié)作為預(yù)后指標?這兩個變量之間沒有明顯的統(tǒng)計學(xué)聯(lián)

28、系(P=0.11)，因此可以明確高S-TK1濃度并非淋巴結(jié)狀態(tài)的協(xié)變量。下一步，本實驗繼續(xù)評價高S-TK1濃度是否與其它已知的臨床及病理指標相關(guān)。經(jīng)過統(tǒng)計學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)高S-TK1濃度與腫瘤大小(P=0.15)、淋巴結(jié)狀態(tài)(P=0.11)、ER(P=0.63)、PR(P=0.45)、及HER-2(P=0.89)均沒有明顯相關(guān)，由此提示S-TK1濃度是一個獨立的預(yù)后指標。
　　 (3)為了進一步驗證局部晚期乳腺癌新輔助化療后血清

29、中S-TK1濃度可以作為獨立的預(yù)后指標，我們用COX回歸分析來比較S-TK1及其它已知的臨床病理指標所預(yù)示的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險(表2)及腫瘤相關(guān)死亡風(fēng)險(表3)。無論對于DFS還是腫瘤相關(guān)死亡，S-TK1過表達及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)狀態(tài)都是預(yù)后指標。新輔助化療后，血清中S-TK1高濃度患者較低濃度患者腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險明顯增高(P=0.003)。作為對照，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移到患者較未轉(zhuǎn)移患者的腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險明顯增高(P=0.002)。
　　 結(jié)論：
　

30、　 (1)血清中S-TK1高的患者較血清中S-TK1低的患者有更高的復(fù)發(fā)風(fēng)險及癌癥相關(guān)的死亡。
　　 (2)S-TK1濃度可以作為局部晚期乳腺癌的一個相關(guān)預(yù)后指標。
　　 創(chuàng)新性及意義：
　　 1.本課題首次檢測了乳腺癌外周血TK1的表達情況，通過臨床資料分析、病例隨訪，闡述了外周血TK1的表達與病人轉(zhuǎn)移和預(yù)后的相關(guān)性。
　　 2.本課題首次研究了TK1在乳腺癌組織與病人外周血中的表達情況，深入探討了T