在乳腺癌中TRAF2與TRAF4結(jié)合及其對(duì)TRAF4核漿穿梭的影響.pdf

1、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(Tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)是一類重要的胞漿銜接蛋白，它們參與多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，引發(fā)相應(yīng)的基因活化，其中最主要的是引起NF-κB和JNK的活化，從而調(diào)節(jié)正常和腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、凋亡并誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞出芽等。迄今為止共發(fā)現(xiàn)7種TRAFs家族成員，參與多個(gè)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化，免疫共沉淀試驗(yàn)表明，刺激TNF家族受體可誘導(dǎo)TRA

2、F4/p70S6K復(fù)合物的形成，TNF通過TRAF4使S6蛋白發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活p70S6K，即TRAF4起到抑制調(diào)亡的作用；其中TRAF2是TRAF家族的核心成，主要參與TNFR家族的信號(hào)傳導(dǎo)。TRAF4是TRAF家族中唯一在細(xì)胞核表達(dá)尚未見與其它TRAF家族成員相互作用的報(bào)道。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用基因的轉(zhuǎn)染／干擾，免疫熒光染色／激光共聚焦，免疫共沉淀，Western Blot，，流式細(xì)胞計(jì)量(FCM)方法研究TRAF2在

3、乳腺癌細(xì)胞中影響TRAF4核漿穿梭及其生物學(xué)功能分析。
　　 材料與方法:
　　 1、材料
　　 正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，人雌激素受體依賴性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7（低轉(zhuǎn)移），人雌激素受體非依賴性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231（中轉(zhuǎn)移）和MDA-MB-435s（高轉(zhuǎn)移）。
　　 2、方法
　　 (1)細(xì)胞培養(yǎng)：正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A，，低轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7以及中轉(zhuǎn)移性

4、乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231，高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-435s。
　　 (2)免疫熒光染色：檢測(cè)TRAF2與TRAF4的核漿定位及其共定位。
　　 (3)轉(zhuǎn)染：按照LipofectAMINE2000說明書操作。
　　 (4)免疫共沉淀：檢測(cè)TRAF2與TRAF4的結(jié)合狀況。
　　 (5)應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染TRAF2前后，TRAF4的變化：檢測(cè)干擾TRAF2前后TRAF4

5、的變化。
　　 (6)應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染和干擾TRAF4后，細(xì)胞的侵襲性改變。
　　 結(jié)果:
　　 1、免疫熒光染色顯示TRAF2與TRAF4在MCF-7細(xì)胞中的定位及在胞漿中的共定位
　　 在MCF-7細(xì)胞中可看到TRAF2在細(xì)胞漿中陽性表達(dá)，呈現(xiàn)胞膜胞核紅色熒光染色；TRAF4在胞膜胞漿及胞核中均呈現(xiàn)綠色熒光表達(dá)；通過激光共聚焦顯微鏡可以觀察到TRAF2與TRAF4共定位于細(xì)胞漿中，呈現(xiàn)黃色熒光顯

6、色。
　　 2、免疫共沉淀檢測(cè)TRAF2和TRAF4在乳腺癌細(xì)胞系中的結(jié)合情況
　　 TRAF2與TRAF4在MCF-10A（正常）、MCF-7（低轉(zhuǎn)移）MDA-MB-231（中度轉(zhuǎn)移）、MDA-MB-435s（高轉(zhuǎn)移）四種細(xì)胞系中均結(jié)合。
　　 3、通過Western-blot的方法，TRAF2在乳腺癌細(xì)胞中影響TRAF4的核漿穿梭
　　 在干擾了TRAF2的MDA-MB-231（中度轉(zhuǎn)移）細(xì)胞系中，T

7、RAF4的核蛋白表達(dá)量增高，而胞漿中TRAF4的表達(dá)量降低；在轉(zhuǎn)染了TRAF2的MDA-MB-231（中度轉(zhuǎn)移）細(xì)胞系中，TRAF4的核蛋白表達(dá)量降低，而胞漿中TRAF4的表達(dá)量增高。
　　 4、TRAF4對(duì)細(xì)胞生物學(xué)影響，轉(zhuǎn)染了TRAF4后對(duì)細(xì)胞的凋亡起抑制作用
　　 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染了TRAF4的MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率1.73％低于正常MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率為2.26％。表明轉(zhuǎn)染TRAF4

8、質(zhì)?？梢种迫橄侔┘?xì)胞凋亡；干擾TRAF4后MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率9.95％高于正常MDA-MB-231細(xì)胞凋亡率為2.26％，表明TRAF4可抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1、在正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF-10A及乳腺癌各種侵襲度的細(xì)胞系中TRAF2與TRAF4均可以結(jié)合。TRAF2主要表達(dá)與細(xì)胞胞漿及包膜中，而TRAF4在細(xì)胞核與細(xì)胞漿中均有表達(dá)；免疫熒光／激光共聚焦顯示TRAF2與TRAF4在胞漿中

9、有共定位表達(dá)。
　　 2、我們?cè)谟跀_了TRAF2后，對(duì)MDA-MB-231（中轉(zhuǎn)移）細(xì)胞系中的核漿蛋白分離后測(cè)定TRAF4核漿蛋白的表達(dá)量，TRAF4的核表達(dá)量明顯增高，而漿表達(dá)量明顯下調(diào)；在對(duì)MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)染TRAF2后，通過western-Blot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)TRAF4的核表達(dá)量下調(diào)而漿表達(dá)量提高。而前期實(shí)驗(yàn)證明TRAF4隨侵襲性增加而核內(nèi)蛋白表達(dá)量降低，故推測(cè)TRAF2與TRAF4結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。