超聲聯(lián)合一氧化氮微泡增效間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療心肌梗死及機制的實驗研究.pdf

1、背景：不斷提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)移植治療心肌梗死(MI)效率是亟待解決的問題。近期多項實驗研究發(fā)現(xiàn)超聲聯(lián)合微泡干預(yù)有增效干細(xì)胞移植治療MI的作用，具有良好的應(yīng)用前景。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)超聲聯(lián)合一氧化氮(NO)微泡體外干預(yù)MSCs對其增殖、凋亡以及細(xì)胞周期無顯著影響。超聲聯(lián)合NO微泡介導(dǎo)MSCs移植治療MI的體內(nèi)效應(yīng)及機制的研究尚屬空白。
　　目的：1.探討超聲聯(lián)合NO微泡促進經(jīng)靜脈移植MSCs歸巢大鼠缺血心肌的可行性及

2、可能機制；2.探討超聲聯(lián)合NO微泡干預(yù)MSCs移植改善梗死后心功能的有效性及可能機制。
　　方法：1、大鼠骨髓MSCs的分離培養(yǎng)、鑒定及標(biāo)記：密度梯度離心法分離培養(yǎng)大鼠骨髓MSCs；形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞儀檢測CD44、CD29、CD34及CD45進行MSCs鑒定；CM-Di1體外標(biāo)記MSCs，熒光顯微鏡觀察標(biāo)記效率。2、大鼠MI模型的制備與評價：冠狀動脈左前降支結(jié)扎法建立大鼠MI模型，以心電圖、血清學(xué)、影像學(xué)及病理學(xué)等指標(biāo)評價模型

3、制備成功與否。3、超聲聯(lián)合NO微泡干預(yù)MSCs移植治療心肌梗死的效應(yīng)及機制：①40只大鼠成功制備MI模型一周后隨機分為PBS組、MSCs組、超聲聯(lián)合微泡組及超聲聯(lián)合NO微泡組(n=10)。PBS組直接從尾靜脈注射2mLPBS，其余不作干預(yù)；MSCs組直接將CM-Di1標(biāo)記的MSCs約1×107細(xì)胞量用2mLPBS稀釋后經(jīng)靜脈緩慢注射，其余不作干預(yù)；超聲+微泡+MSCs組首先經(jīng)尾靜脈注入普通聲諾維微泡0.1mL/kg，注入微泡同時啟動超聲

4、，1MHz、2W/cm2，作用10分鐘，作用結(jié)束后將CM-Di1標(biāo)記的MSCs約1×107細(xì)胞量用2mLPBS稀釋后靜脈緩慢注射；超聲+NO微泡+MSCs組移植方法及條件同超聲+微泡+MSCs組，僅將普通微泡換作NO微泡，用量同普通微泡。②干預(yù)后48h隨機處死每組各3只大鼠，取梗死區(qū)心肌組織作冰凍切片，計數(shù)比較各組缺血心肌內(nèi)熒光標(biāo)記陽性MSCs。③4周后對每組剩余大鼠行M型心臟超聲觀察比較各組左心室收縮功能。④心功能檢測結(jié)束后處死所有大

5、鼠，取梗死區(qū)心肌組織行石蠟切片及HE染色，計數(shù)比較各組心肌缺血區(qū)的毛細(xì)血管密度，同時應(yīng)用Western-blotting及RealTime PCR檢測比較局部心肌SDF-1、VEGF的表達水平。
　　結(jié)果：1、密度梯度離心法分離培養(yǎng)的MSCs貼壁生長，以梭形為主，形態(tài)較均一。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示細(xì)胞表面高表達CD44(99.34％)及CD29(99.35％)，幾乎不表達CD34(1.47％)及CD45(1.56％)。熒光顯微鏡觀察

6、顯示絕大部分細(xì)胞均可被CM-Di1標(biāo)記，細(xì)胞膜呈均勻明亮的紅色，CM-Di1標(biāo)記的陽性率約為96.72％。2、冠狀動脈左前降支結(jié)扎法建立MI模型后，心電圖呈現(xiàn)ST段偏移、病理性Q波等動態(tài)變化，TnI、CK-MB明顯升高，Masson染色左室前壁梗死區(qū)呈藍染，左室收縮功能明顯降低。3、熒光顯微鏡觀察計數(shù)各組心肌缺血區(qū)CM-Di1陽性MSCs顯示：超聲+NO微泡+MSCs組熒光陽性細(xì)胞數(shù)為59.22±17.63個，較超聲+微泡+MSCs組(

7、45.33±14.97)及MSCs組(31.88±5.71)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。4、心功能檢測結(jié)果顯示：超聲+NO微泡+MSCs組EF值為56.27±3.66％，較超聲+微泡+MSCs組(51.31±3.22％)、MSCs組(45.81±3.37％)及PBS組(43.66±4.79％)顯著改善，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。5、平均毛細(xì)血管密度計數(shù)結(jié)果顯示：超聲+N0微泡+MSCs組平均毛細(xì)血管密度為45.96±

8、9.10個，較超聲+微泡+MSCs組(28.07±4.93)、MSCs組(21.41±5.27)及PBS組(18.04±4.82)增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。6、Western-blotting及Real Time PCR檢測結(jié)果顯示：超聲+NO微泡+MSCs組SDF-1、VEGF的表達水平較其他各組升高。
　　結(jié)論：1.密度梯度離心法可成功實現(xiàn)大鼠BMSCs的分離培養(yǎng)。2.冠狀動脈左前降支結(jié)扎法可建立穩(wěn)定的大鼠MI模