磁性粒子表面修飾及其在功能性小分子作用組學(xué)研究中的應(yīng)用.pdf

1、本文介紹了以磁性粒子為載體,通過其表面的化學(xué)基團(tuán)分別連接天然產(chǎn)物石杉堿甲（Hup A）和二腺苷四磷酸（Ap4A）,經(jīng)過磁分離,分別從噬菌體cDNA展示庫和哺乳動物的腦組織裂解液里篩選Hup A的靶點(diǎn),以及從原核生物細(xì)胞裂解液和真核生物組織裂解液里篩選Ap4A的靶點(diǎn)的研究。通過毛細(xì)管電泳技術(shù)分析了篩選出的特異性噬菌體與Hup A的結(jié)合,又通過表面等離子共振技術(shù)驗(yàn)證了經(jīng)體外克隆表達(dá)的篩選到的特異性噬菌體基因所在蛋白與Hup A的結(jié)合。

2、>　　本論文首先采用化學(xué)共沉淀的方法,以用乳酸聚合而成的醇酸聚合物為高分子模板,制備出表面帶有羧基的磁性粒子。通過羧基與其它化學(xué)基團(tuán)的反應(yīng),可以有效地連接各種生物活性分子或藥物，且連接后的磁性粒子可以穩(wěn)定存在于水溶液中并具有順磁性，因而在生物醫(yī)學(xué)分離等領(lǐng)域具有潛在的應(yīng)用價值。
　　功能性小分子,特別是天然產(chǎn)物,是現(xiàn)代醫(yī)藥的主要來源,在幫助人類戰(zhàn)勝病魔的過程中,發(fā)揮著舉足輕重的作用。根據(jù)天然產(chǎn)物的來源我們往往可以判斷出它們的功能,而

3、且在一些疾病模型上也部分驗(yàn)證了其治療作用,但大多天然產(chǎn)物沒有明確的分子靶點(diǎn)，有些作用機(jī)制尚不清楚，這就為尋找和合成天然產(chǎn)物的類似物或替代品或更優(yōu)產(chǎn)品,以及進(jìn)一步揭示疾病的病因等造成一定的困難。因而結(jié)合已有的藥物靶點(diǎn)篩選技術(shù),建立更行之有效的天然產(chǎn)物靶點(diǎn)篩選方法以找到其可能的未知作用靶點(diǎn),成為加速現(xiàn)代醫(yī)藥進(jìn)程的關(guān)鍵步驟。
　　本論文首先將我國傳統(tǒng)中草藥蛇足石杉的有效成分Hup A連接在磁性粒子的表面，分別從噬菌體cDNA展示庫和哺乳

4、動物腦組織裂解液中進(jìn)行靶點(diǎn)篩選。通過幾輪磁生物淘洗，親和篩選出二種重復(fù)出現(xiàn)的對Hup A特異性結(jié)合的噬菌體。通過PCR、基因測序和序列比對，在基因庫中找到特異性噬菌體展示基因所在的蛋白，并通過毛細(xì)管電泳技術(shù)檢測了兩種特異性噬菌體以及一種非特異性噬菌體與Hup A的體外結(jié)合，結(jié)果表明篩選出的兩種特異性噬菌體和Hup A之間具有一定的結(jié)合，而非特異性噬菌體與Hup A基本沒有結(jié)合,從而排除了篩選到的噬菌體是磁性粒子非特異性吸附的結(jié)果的可能性

5、。再通過原核表達(dá)的方法,對其中一種特異性噬菌體展示基因所在的功能性蛋白-線粒體NADH脫氫酶subunit1進(jìn)行了體外表達(dá)及純化,并通過表面等離子共振技術(shù)檢測了純化后的蛋白與Hup A之間的結(jié)合,得到了二者之間的結(jié)合常數(shù),說明二者之間確實(shí)存在一定的相互作用。通過真核組織裂解液的篩選，又一功能蛋白mitochondria ATP synthase被重復(fù)篩選出來。所有這些結(jié)果，再結(jié)合他人關(guān)于Hup A功能的研究，在很大程度上說明Hup A很

6、可能通過對神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能的調(diào)節(jié)來治療阿爾茨海默癥（AD），而線粒體的某些功能蛋白，比如NADH脫氫酶subunit1和ATP synthase則有可能成為Hup A的新的作用靶點(diǎn)。具體地說，通過與這些酶相互作用，Hup A很可能作為他們的激動劑改善其活性，從而促進(jìn)氧化呼吸鏈的電子傳遞，增加ATP的產(chǎn)生和能量的新陳代謝，來滿足AD以及其它神經(jīng)退行性疾病病人的受損神經(jīng)元對于能量的需求。
　　除了Hup A以外，我們還在體外化學(xué)合成

7、了帶有生物素的Ap4A，并將其連接到表面包被有鏈霉親和素的磁性粒子上。同樣通過磁生物淘洗，分別從大腸桿菌細(xì)胞和哺乳動物組織裂解液里篩選 Ap4A的結(jié)合蛋白。對于原核篩選來說，一個特異性的蛋白條帶在六次篩選過程中均被重復(fù)篩選到；而對于真核篩選來說，4個特異性的蛋白條帶被重復(fù)篩選到。經(jīng)質(zhì)譜鑒定，Ap4A的已知靶點(diǎn)GroEL被篩選出來。這不僅表明磁生物淘洗方法在功能性小分子靶點(diǎn)篩選中的可行性，而且加大了其它被篩選出的蛋白,特別是IMP deh

8、ydrogenase和部分真核熱休克家族蛋白（Hsp）成為Ap4A未知靶點(diǎn)的可能性?？梢哉f本部分實(shí)驗(yàn)是磁性粒子在天然產(chǎn)物靶點(diǎn)篩選中的又一個嘗試性的應(yīng)用，也是對將此方法應(yīng)用在Hup A靶點(diǎn)篩選上的延伸和驗(yàn)證。
　　兩部分實(shí)驗(yàn)充分證明，通過與噬菌體展示技術(shù)和質(zhì)譜基礎(chǔ)上的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，以磁性粒子為基質(zhì)的親和淘洗色譜將可能成為鑒定功能性小分子，特別是天然產(chǎn)物的未知靶點(diǎn)的一種新的有效的方法，為進(jìn)一步研究功能性小分子的分子作用機(jī)制，體