三個改造后的Bt抗蟲基因在煙草中的殺蟲活性研究.pdf

1、棉鈴蟲(Helicoverpa armigera Hubner)屬于鱗翅目夜蛾科，在世界各地廣泛分布，是棉花生產(chǎn)最嚴重的害蟲之一。20世紀80、90年代，棉鈴蟲在全世界主要產(chǎn)棉區(qū)大面積暴發(fā)，導致棉花嚴重減產(chǎn)，造成巨大的經(jīng)濟損失。經(jīng)過20多年的研究和生產(chǎn)應用，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉取得了巨大的生態(tài)和經(jīng)濟效益。然而隨著抗蟲棉的大面積種植，在高生態(tài)選擇壓作用下，棉鈴蟲對抗蟲基因產(chǎn)生抗性的風險也逐漸增加。通過對Bt蛋白的殺蟲機理研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)單一Bt基

2、因棉花的大面積推廣應用容易導致昆蟲產(chǎn)生抗性。因此，通過發(fā)掘不同殺蟲機理的Bt基因，創(chuàng)制含有不同殺蟲機理復合抗蟲棉花新材料，已經(jīng)成為當前抗蟲棉花基因工程的研究熱點。轉(zhuǎn)復合抗蟲基因棉花，不僅可以提高殺蟲效率，而且可有效地避免或延遲昆蟲的抗性發(fā)生。cry2Ah2，cry2Ab4，vip3Aa11是從蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，Bt)中克隆到的3個新型Bt晶體蛋白殺蟲基因。其中Cry2Ah2和Cry2Ab4是在

3、孢子形成期產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白(Insecticidal crystalproteins，ICPs)，對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目等多種昆蟲具有毒殺功能。Vip3Aa11是一種營養(yǎng)期殺蟲蛋白（Vegetative insecticidal proteins，VIPs），對棉鈴蟲、小地老虎等一系列鱗翅目害蟲均有較高的毒性作用。
　　本研究依據(jù)棉花遺傳密碼子偏好性，對cry2Ah2，cry2Ab4，vip3Aa11基因進行了密碼子優(yōu)化改造，

4、改造后的三個基因克隆到pGBI121植物表達載體，構建成pGBI-cry2Ah2(35S∷cry2Ah2:Nos)、pGBI-cry2Ab4(35S∷cry2Ab4:Nos)和pGBI-vip3Aa11(35S∷vip3Aa11: Nos)單基因表達載體。農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草NC89（Nicotiana tabacum L.）后，分別獲得30株轉(zhuǎn)cry2Ah2基因陽性煙草植株，33株轉(zhuǎn)cry2Ab4基因陽性煙草植株，40株轉(zhuǎn)vip3Aa

5、11基因陽性煙草植株。熒光定量PCR結果表明，三個抗蟲基因的陽性轉(zhuǎn)基因煙草植株均能穩(wěn)定地高水平地表達外源抗蟲基因，我們分別選取了表達水平較高的轉(zhuǎn)基因植株進行Southern blot檢測，三個基因已經(jīng)整合到煙草基因組中，其中轉(zhuǎn)cry2Ah2基因煙草進一步通過Western blot實驗在蛋白水平驗證了其表達。生物活性檢測結果表明，用轉(zhuǎn)cry2Ah2，cry2Ab4，vip3Aa11基因煙草葉片分別飼喂初孵棉鈴蟲幼蟲，4天后幼蟲校正死亡率

6、分別在86.59％，86.51％和87.70％以上，均達到高抗水平，其中，轉(zhuǎn)vip3Aa11植株抗蟲效果優(yōu)于轉(zhuǎn)cry2Ah2和cry2Ab4植株，轉(zhuǎn)cry2Ah2與cry2Ab4基因植株抗蟲水平相當。這一結果表明cry2Ah2，cry2Ab4，vip3Aa11三個基因為現(xiàn)有抗蟲棉的深化研究提供了新的抗性基因源。
　　本研究證實了3個基因均可以在模式植物中高水平表達，并使轉(zhuǎn)基因煙草具有高抗蟲性，是防治棉鈴蟲等害蟲的新型候選抗蟲基因，