胰腺癌5-氟尿嘧啶(5-FU)耐藥相關(guān)蛋白篩查及胰腺癌候選免疫原性膜抗原SLP-2和Prohibitin分子生物學(xué)功能研究.pdf

1、背景:
　　胰腺癌是消化系統(tǒng)中惡性程度較高、預(yù)后極差的腫瘤，其發(fā)生發(fā)展機制尚未闡明。實現(xiàn)早期診斷與增強化療效果，是胰腺癌診治過程中的重點與難點。5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是第一個用于胰腺癌化療的藥物，目前仍然廣泛應(yīng)用、具有一定療效，5-FU耐藥性是限制該藥應(yīng)用的主要困擾。國內(nèi)外多項對5-FU敏感/耐藥的胰腺癌或其他腫瘤細胞株的基因芯片與蛋白質(zhì)組學(xué)篩查，獲得了一些差異蛋白，但是重合率并不好，可能與基因芯片

2、探針數(shù)及二維凝膠電泳所導(dǎo)致的檢測通量不足有關(guān)。在早期診斷方面，本實驗室前期工作發(fā)現(xiàn)了9個胰腺癌免疫相關(guān)原性膜抗原，同時已對兒茶酚胺氧位甲基轉(zhuǎn)移酶（Catechol-O-Methyltransferase，COMT）、抗增殖蛋白(prohibitin，PHB)、電壓依賴離子通道(Voltage-Dependent Anionchannel，VDAC(l))進行了一定程度的生物功能研究與標(biāo)志物有效性驗證，Stomatin樣蛋白2（stoma

3、tin like protein 2，SLP-2，Stoml2）等其他候選蛋白的研究還有待繼續(xù)深入。
　　目的:
　　1.驗證人胰腺癌細胞系親本株P(guān)aTu8988/-與5-FU耐藥株P(guān)aTu8988/FU對5-FU的藥物敏感性差異。
　　2.篩查親本株P(guān)aTu8988/-與耐藥株P(guān)aTu8988/FU的差異表達基因及蛋白。
　　3.研究SLP-2蛋白在人胰腺癌細胞系中的生物學(xué)功能。
　　4.完善prohib

4、itin蛋白過表達后所發(fā)生的細胞功能改變的研究。
　　材料與方法:
　　1.應(yīng)用CCK-8法檢測人胰腺癌細胞系親本株P(guān)aTu8988/-與5-FU耐藥株P(guān)aTu8988/FU對5-FU的IC50差異。
　　2.應(yīng)用Annexin V/PI雙染法分析親本株P(guān)aTu8988/-與耐藥株P(guān)aTu8988/FU在5-FU誘導(dǎo)下發(fā)生細胞凋亡的差異。
　　3.應(yīng)用Affymetrix人全轉(zhuǎn)錄組外顯子芯片GeneChip(@)

5、 Exon1.0 ST Array篩查親本株P(guān)aTu8988/-與耐藥株P(guān)aTu8988/FU的基因表達差異。
　　4.應(yīng)用同位素標(biāo)記相對和絕對定量技術(shù)(Isobaric tags for relative andabsolute quantitation，iTRAQ)結(jié)合Triple TOFTM 5600高分辨液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)篩查親本株P(guān)aTu8988/-與耐藥株P(guān)aTu8988/FU的蛋白表達差異。
　　5.應(yīng)用qP

6、CR及Western blotting法檢測SLP-2在9株人胰腺癌細胞系(Capan-1、Panc-1、MIAPaCa-2、T3M4、AsPC-1、BxPC-3、PaTu8988、Su86.86、SW1990)中的表達水平。
　　6.構(gòu)建pIERS2-EGFP(+)-SLP2過表達系統(tǒng)與SLP-2 siRNA抑制系統(tǒng)，分別瞬時過表達或抑制SLP-2蛋白在細胞系MIAPaCa-2與BxPC-3中的表達水平。應(yīng)用CCK-8法、Tra

7、nswell法觀察并對比干預(yù)前后胰腺癌細胞在增殖、遷移與侵襲能力的變化。
　　7.應(yīng)用qPCR及Western blotting法檢測prohibitin在9株人胰腺癌細胞系(Capan-1、Panc-1、MIAPaCa-2、T3M4、AsPC-1、BxPC-3、PaTu8988、Su86.86、SW1990)中的表達水平。
　　8.構(gòu)建pIERS2-EGFP(+)-prohibitin過表達系統(tǒng)，瞬時過表達prohibit

8、in蛋白在細胞系MIAPaCa-2中的表達水平。應(yīng)用CCK-8法、Transwell法觀察并對比干預(yù)前后胰腺癌細胞在增殖、遷移與侵襲能力的變化。
　　結(jié)果:
　　1.CCK-8法耐藥敏感性檢測測定兩株細胞50％抑制濃度IC50，PaTu8988/-IC50=4.49±0.60μ g/ml, PaTu8988/Fu IC50=79.19±21.55μ g/ml，具有顯著性差異(p=0.0002)，耐藥系數(shù)RI=17.64。

9、r>　　2.細胞凋亡分析（Annexin V/PI雙染法）提示，在5-FU作用下，親本株P(guān)aTu8988/-較耐藥株P(guān)aTu8988/Fu更易出現(xiàn)細胞凋亡現(xiàn)象。2500μ g/ml5-FU作用下，親本株P(guān)aTu8988/-凋亡率可達45.47±2.14％，而耐藥株P(guān)aTu8988/Fu凋亡率只有22.33±2.21％。
　　3.轉(zhuǎn)錄組外顯子芯片篩查，發(fā)現(xiàn)親本株P(guān)aTu8988/-與5-FU耐藥株P(guān)aTu8988/FU差異表達mRN

10、A2052條，其中PaTu8988/FU較PaTu8988/-上調(diào)(＞2.0)1828條，下調(diào)(＜0.5)224條。
　　4.蛋白質(zhì)組學(xué)篩查，發(fā)現(xiàn)親本株P(guān)aTu8988/-與5-FU耐藥株P(guān)aTu8988/FU差異表達蛋白353個，其中PaTu8988/FU較PaTu8988/-上調(diào)(＞1.5)259個，下調(diào)(＜0.7)94個。
　　5.基因芯片篩查與差異蛋白質(zhì)組學(xué)篩查共同篩出PaTu8988/FU較PaTu8988/-差異

11、蛋白69個，上調(diào)蛋白ABCD3、MTHFD1L、TP53I3、POLA1、SRGAP1、C5等54個，下調(diào)蛋白EPCAM、MCAM等15個。
　　6.slp-2蛋白在9株人胰腺癌細胞系中均有明確表達，但表達量各有差異。結(jié)合qPCR與Western blotting結(jié)果在MIAPaCa-2中表達量較低，在BxPC-3中表達量較高，BxPC-3細胞系SLP-2表達量是MIAPaCa-2的3倍(p＜0.005)。
　　7.在體外水

12、平，pIERS2-EGFP(+)-SLP2過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72小時后，SLP-2蛋白表量可趨近高值，過表達組較對照組SLP-2蛋白表達量調(diào)高至近3倍(p＜0.05)，過表達組增殖、遷移、侵襲能力明顯提高(p＜0.005，p=0.0001，p＜0.0001);SLP-2 siRNA轉(zhuǎn)染48小時后，SLP-2蛋白表量可趨近低限，抑制組SLP-2蛋白表達量降至對照組的1/2(p＜0.05)，抑制組細胞增殖、遷移、侵襲能力明顯降低(p＜0.05，

13、p＜0.0001，p=0.0020)。
　　8.Prohibitin蛋白在9株人胰腺癌細胞系中均有明確表達，但表達量各有差異。結(jié)合qPCR與Western blotting結(jié)果在MIAPaCa-2中表達量較低，在SW1990、AsPC-1、BxPC-3中表達量較高，AsPC-1細胞系prohibitin表達量是MIAPaCa-2的2-3倍(p＜0.005)。
　　9.在體外水平，pIERS2-EGFP(+)-prohibit

14、in過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72小時后，prohibitin蛋白表量可趨近高值，過表達組較對照組prohibitin蛋白表達量調(diào)高至近1.5倍(p＜0.005)。過表達組增殖、遷移、侵襲能力明顯提高(p＜0.001, p＜0.0001, p=0.0005)。
　　結(jié)論:
　　1.人胰腺癌細胞系親本株P(guān)aTu8988/-與5-FU耐藥株P(guān)aTu8988/FU對5-FU藥物敏感性存在差異，后續(xù)耐藥蛋白篩查實驗有意義。
　　2.ABC