兒童口腔高毒力變形鏈球菌HtrA缺陷株的構(gòu)建鑒定及轉(zhuǎn)化力的研究.pdf

1、 目的：在前期,本實(shí)驗(yàn)組人員已經(jīng)完成乳牙齲高毒力株篩選及重組質(zhì)粒載體pUChtrKO 的構(gòu)建,本實(shí)驗(yàn)要將已篩選出的變形鏈球菌 HtrA 高毒力菌株復(fù)蘇并在液體培養(yǎng)基 TPY 中增菌制備感受態(tài)刺激肽細(xì)胞[1],然后再向其中加入已經(jīng)構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒,通過基因的同源重組[2]來構(gòu)建變形鏈球菌HtrA基因缺陷株。并使用細(xì)胞生物學(xué)、分子學(xué)等手段,對(duì)變形鏈球菌HtrA缺陷菌株進(jìn)行進(jìn)行細(xì)菌鑒定,確定為變形鏈球菌后再通過PCR擴(kuò)增技術(shù)來鑒定以構(gòu)建完

2、成的細(xì)菌是否為變形鏈球菌HtrA缺陷株。最后將以構(gòu)建完成的變形鏈球菌HtrA缺陷株和變形鏈球菌HtrA高毒力株經(jīng)過增菌并系列稀釋后,在紅霉素的TSB平板上分別培養(yǎng)計(jì)數(shù)。通常以菌落數(shù)的多少,來評(píng)價(jià)變形鏈球菌HtrA基因缺陷菌株轉(zhuǎn)化力的高低。從而來判斷兒童口腔變形鏈球菌的致齲性是否受HtrA的調(diào)控,如果受它調(diào)控就可以為兒童齲病的防治找到新靶點(diǎn)[3] [4]。
方法：①構(gòu)建變形鏈球菌高毒力株HtrA缺陷菌珠：已篩選出的變形鏈球菌

3、HtrA 高毒力菌株常規(guī)復(fù)蘇厭氧培養(yǎng) 48 小時(shí),經(jīng)鑒定為生長(zhǎng)良好的變形鏈球菌菌落后在液體培養(yǎng)基TPY中增菌并制備出感受態(tài)刺激肽細(xì)胞,然后再向其中加入已經(jīng)構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒載體[5],通過基因的同源重組進(jìn)行變形鏈球菌高毒力株HtrA基因缺陷株的構(gòu)建。將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的變形鏈球菌高毒力株經(jīng)過倍比稀釋后吸取120μl涂布在含紅霉素的TSA-Eymr固體培養(yǎng)基平 板上,在溫度37℃的條件下進(jìn)行孵箱培養(yǎng),大約需要24~48h,然后挑取菌落涂片、染色,

4、在顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)進(jìn)行初步篩選。②變形鏈球菌高毒力株HtrA缺陷菌株的鑒定：根據(jù)HtrA的基因序列來設(shè)計(jì)HtrA基因的引物HtrF/HtrR并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,再以紅霉素抗性基因引物P1/P2, HtrA基因上游引物序列合并紅霉素抗性基因引物HtrAUF/P1, HtrA基因下游引物序列合并紅霉素抗性基因引物HtrAUR/P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并將已經(jīng)進(jìn)行了 PCR 擴(kuò)增的四個(gè)基因片段以含有 HtrA 基因的變形鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA

5、為參照進(jìn)行PCR鑒定[6]。③變形鏈球菌HtrA缺陷菌株轉(zhuǎn)化力比較：將乳牙齲變形鏈球菌 HtrA 高毒力株和變形鏈球菌 HtrA 缺陷菌株分別在TPY 液體培養(yǎng)基中增菌, 在 37℃的水浴中培養(yǎng) 90min,經(jīng)過系列稀釋后吸取120μl菌液涂布于于含紅霉素的TSA-Eymr固體培養(yǎng)基平板上, 37℃的條件下孵箱培養(yǎng)24-48h。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定確認(rèn)為變形鏈球菌后行菌落計(jì)數(shù)來判斷二者轉(zhuǎn)化力是否有區(qū)別,可用5次試驗(yàn)結(jié)果的平均值來進(jìn)行最終評(píng)估。

6、
結(jié)果：將構(gòu)建完成的變形鏈球菌HtrA基因缺陷菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)和生化鑒定顯示構(gòu)建成功的細(xì)菌確實(shí)為變形鏈球菌,然后將由HtrA的基因序列來設(shè)計(jì)HtrA基因的引物HtrF/HtrR[7]、紅霉素抗性基因引物P1/P2、HtrA基因上游引物序列合并紅霉素抗性基因引物 HtrAUF/P1[8]、HtrA 基因下游引物序列合并紅霉素抗性基因引物HtrAUR/P2分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增,并與變形鏈球菌HtrA標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA進(jìn)行對(duì)照鑒定[9

7、]。并可使用凝膠自動(dòng)成像分析儀對(duì)經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳的DNA片段進(jìn)行成像分析。其中1~4組為變形鏈球菌HtrA缺陷株組,5~8組為變形鏈球菌HtrA高毒力株組,以分子量為DL2100的變形鏈球菌HtrA標(biāo)準(zhǔn)株DNA作為Marker,圖像顯示第一組在DNA分子量為500bp處未出現(xiàn)特異性的電泳條帶,而第五組在此處卻 出現(xiàn)了一條較明亮的特異性條帶,500bp為HtrA基因片段的DNA分子量。第二組在DNA分子量為710bp處出現(xiàn)一條明顯

8、的亮條帶,而第六組在此處卻未出現(xiàn)特異性條帶,710bp 為紅霉素抗性基因片段的 DNA 分子量[10]。第三、四組分別在DNA分子量為1200bp和1100bp處各出現(xiàn)一條明亮的條帶。而第七、八組均未出現(xiàn)特異性條帶,1200bp和1100bp又分別為HtrA基因上游引物序列合并紅霉素抗性基因引物HtrAUF/P1和HtrA基因下游引物序列合并紅霉素抗性基因引物HtrAUR/P2的DNA分子量。
變形鏈球菌HtrA高毒力株與

9、變形鏈球菌HtrA基因缺陷菌株的轉(zhuǎn)化力比較
結(jié)果：0~6 小時(shí)內(nèi),變形鏈球菌 HtrA 高毒力株和 HtrA 缺陷株都沒有明顯的生長(zhǎng),P>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
6~12小時(shí)內(nèi),變形鏈球菌HtrA高毒力株和HtrA缺陷株都在逐漸增多,但增長(zhǎng)的速度都不是很快,P<0.05,說明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
12~24小時(shí)內(nèi),變形鏈球菌HtrA高毒力株和HtrA缺陷株在明顯的增長(zhǎng),增長(zhǎng)速度較快,P<0.01,

10、具有十分顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
24~48小時(shí)內(nèi),變形鏈球菌HtrA高毒力株和HtrA缺陷株再無沒顯著增長(zhǎng), P>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
但總體來講,變形鏈球菌 HtrA 高毒力株的增長(zhǎng)速度,要高于變形鏈球菌HtrA缺陷株,P>0.05,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論：通過基因重組等方法可以將變形鏈球菌HtrA高毒力株中的HtrA基因敲除,經(jīng)過 PCR 鑒定與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符,從而成功構(gòu)建變形鏈球菌 HtrA的