Cripto-1(CR-1)在鼻咽癌中的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的: 鼻咽癌是我國(guó)南方及東南亞地區(qū)常見(jiàn)的一種頭頸部惡性腫瘤。目前普遍認(rèn)為EB病毒、化學(xué)致癌物和遺傳易感性是促使鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的三大因素，但NPC的分子發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。由于鼻咽癌是一種低分化、高轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤，且其發(fā)生部位較為隱蔽，因此多數(shù)病人在確診時(shí)都為中、晚期且常伴有轉(zhuǎn)移，且治療后五年生存率始終在60%以下，因此繼續(xù)探索鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制、尋找有價(jià)值的早期診斷生物標(biāo)志物及治療靶標(biāo)仍具有重要意義。 人

2、Cripto-1（CR-1），是表皮生長(zhǎng)因子-CFC（epidermal growth factor-Cripto-1/FRL1/cryptic，EGF-CFC）家族成員，是一個(gè)由188個(gè)氨基酸組成的細(xì)胞外糖蛋白，為早期胚胎發(fā)生所必須。Cripto-1在體內(nèi)有兩種活性形式：一是通過(guò)糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）鍵錨定于細(xì)胞膜上作為復(fù)合受體；二是GPI鍵斷裂后以可溶性分泌蛋白的形式作為生

3、長(zhǎng)因子樣的配體。雖然Cripto-1是胚胎干細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志，成體內(nèi)通常不表達(dá)，但卻過(guò)表達(dá)于75%-80%的乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌以及50%-60%的胃癌、胰腺癌、卵巢癌及睪丸癌。此外，Cripto-1的表達(dá)在諸如結(jié)腸腺瘤、胃的腸上皮化生及乳腺導(dǎo)管原位癌等癌前病變中亦顯著提高。Caterina等2006年報(bào)道血漿Cripto-1水平可作為是早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌和乳腺癌的生物標(biāo)志物。體外實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因鼠研究均表明，Cripto-1通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖、生

4、存、遷移、侵襲和誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT）及腫瘤血管形成等在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮瘤基因的重要作用。由于Cripto-1在腫瘤組織高表達(dá)，正常組織低表達(dá)甚至不表達(dá)，因此它也是惡性腫瘤治療的新靶點(diǎn)。體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)均證明，拮抗Cripto-1的反義寡核苷酸及中和性封閉Cripto-1的單克隆抗體能明顯抑制結(jié)腸癌、乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌及白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)。

5、 盡管目前已證明Cripto-1與某些惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展存在相關(guān)，而且也展現(xiàn)出作為新的早期診斷和分子生物治療靶點(diǎn)的潛力。然而，Cripto-1與鼻咽癌的關(guān)系如何，迄今尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。同時(shí)，Cripto-1為何在腫瘤中重新高表達(dá)，其始動(dòng)因素尚不得而知。因此本課題旨在研究Cripto-1在鼻咽癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)特性；進(jìn)一步通過(guò)改變Cripto-1的表達(dá)水平觀察其對(duì)于鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)特性的影響；最后利用熒光差異雙向凝膠電泳的蛋白組學(xué)方法，初步

6、探討Cripto-1在鼻咽癌發(fā)病機(jī)制中所涉及的信號(hào)通路，從而為進(jìn)一步理解鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制和尋找新的早期診斷與分子靶向治療靶點(diǎn)提供新線索。 研究?jī)?nèi)容與方法: 1.鼻咽癌中Cripto-1表達(dá)特性的鑒定及臨床意義 采用免疫組化、Western blot、熒光定量RT-PCR及RT-PCR方法從蛋白和mRNA水平檢測(cè)Cripto-1在臨床鼻咽癌組織標(biāo)本及鼻咽癌細(xì)胞系CNE1、CNE2、SUNE1、HNE1、HONE

7、1和C666-1中的表達(dá)情況，并分析其與臨床特征的聯(lián)系，探討Cripto-1與鼻咽癌發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。 2. Cripto-1表達(dá)沉默對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE2生物學(xué)特性的影響 利用已知的Cripto-1干擾片段，構(gòu)建含H1啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的慢病毒載體，將慢病毒載體質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞包裝慢病毒，收集病毒上清，進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。 將

8、含Cripto-1特異干擾片段的慢病毒感染CNE2細(xì)胞，以空載體的病毒為陰性對(duì)照，利用GFP的表達(dá)用流式細(xì)胞儀篩選出穩(wěn)定的干擾株。熒光定量PCR法檢測(cè)Cripto-1在干擾前后mRNA的變化；Western blot法檢測(cè)干擾前后Cripto-1蛋白表達(dá)的情況；用MTT法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Cripto-1沉默后對(duì)鼻咽癌細(xì)胞體外增殖能力的影響；利用體外侵襲實(shí)驗(yàn)（Boyden小室）檢測(cè)Cripto-1沉默后對(duì)鼻咽癌細(xì)胞體外侵

9、襲能力的影響。 3. Cripto-1過(guò)表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE1生物學(xué)特性的影響 應(yīng)用PCR、酶切及DNA測(cè)序鑒定Cripto-1真核表達(dá)載體pCI/CR-1。用其轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞CNE1，以空載體pCI/neo為陰性對(duì)照，應(yīng)用G418進(jìn)行篩選獲取Cripto-1穩(wěn)定過(guò)表達(dá)的細(xì)胞克隆。熒光定量PCR法檢測(cè)Cripto-1過(guò)表達(dá)前后mRNA的變化；Western blot法檢測(cè)過(guò)表達(dá)前后Cripto-1蛋白表達(dá)的情況；用MT

10、T法、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Cripto-1過(guò)表達(dá)后對(duì)鼻咽癌細(xì)胞體外增殖能力的影響：利用Boyden小室檢測(cè)Cripto-1過(guò)表達(dá)后對(duì)鼻咽癌細(xì)胞體外侵襲能力的影響。 4.人鼻咽癌細(xì)胞株CNE1/neo和CNE1/CR-1+的蛋白質(zhì)組熒光差異雙向凝膠電泳分析 為了更好的理解Cripto-1在鼻咽癌細(xì)胞中的作用機(jī)理和尋找其所參與的信號(hào)通路，我們運(yùn)用雙向熒光凝膠內(nèi)差異顯示電泳（two-dimensional diff

11、erential in-gel electrophoresis，2D-DIGE）技術(shù)對(duì)穩(wěn)定過(guò)表達(dá)Cripto-1的CNE1/CR-1+及陰性對(duì)照CNE1/neo細(xì)胞進(jìn)行了差異表達(dá)蛋白質(zhì)組分析。經(jīng)圖像軟件分析，獲得有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白質(zhì)點(diǎn)，選擇2倍以上的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，并在mRNA水平對(duì)候選蛋白進(jìn)行初步驗(yàn)證。 結(jié)果: 1.鼻咽癌中Cripto-1表達(dá)特性的鑒定及臨床意義 （1）Cripto-1在鼻咽癌細(xì)

12、胞中的表達(dá)采用Real-time RT-PCR檢測(cè)Cripto-1基因在鼻咽癌細(xì)胞株及鼻咽永生化上皮細(xì)胞NP69中的表達(dá)情況，結(jié)果表明Cripto-1在鼻咽癌細(xì)胞株中的mRNA表達(dá)水平均顯著高于鼻咽永生化上皮細(xì)胞NP69（P<0.05）。SNK多重比較顯示Cripto-1在CNE2細(xì)胞（△△Ct=-11.680±1.074）和C666-1（△△Ct=-10.637±0.637）細(xì)胞中表達(dá)最高，在CNE1細(xì)胞（△△Ct=-3.523±0.

13、648）和HNE1細(xì)胞（△△Ct＝-3.443±1.694）中表達(dá)最低，而HONE1（△△Ct=-6。150±1.536）和SUNE1（△△Ct=-6.447±0.396）細(xì)胞中的表達(dá)水平介于兩者之間。單因素方差分析顯示7種細(xì)胞株中Cripto-1的表達(dá)差異具有顯著性（F=48.783，P<0.001）。Western blot結(jié)果與熒光定量PCR結(jié)果一致。 （2）RT-PCR檢測(cè)Cripto-1在鼻咽癌組織中的表達(dá)共收集17例

14、NPC、7例鼻咽慢性炎標(biāo)本。在17例鼻咽癌組織中，13例Cripto-1呈陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)率為76.5%；7例慢性鼻咽炎中，僅有2例表達(dá)Cripto-1mRNA，陽(yáng)性表達(dá)率為28.6%；兩者表達(dá)水平的差異具有顯著性（P=0.042）。 （3）免疫組織化學(xué)檢測(cè)Cripto-1蛋白在鼻咽癌組織中的表達(dá)SP免疫組化結(jié)果表明，Cripto-1表達(dá)主要定位在鼻咽癌細(xì)胞膜和細(xì)胞漿，而在慢性鼻咽炎組織及腫瘤周圍相對(duì)正常組織、間質(zhì)組織則為弱陽(yáng)

15、性或陰性表達(dá)。37例鼻咽癌組織中，Cripto-1蛋白陽(yáng)性表達(dá)的有20例，而20例慢性鼻咽炎組織中則有4例，兩者表達(dá)水平的差異比較具有顯著性（X2=6.176，P=0.013）。 2.Cripto-1表達(dá)沉默對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE2生物學(xué)特性的影響. 3. Cripto-1過(guò)表達(dá)對(duì)鼻咽癌細(xì)胞CNE1生物學(xué)特性的影響. 4. CNE1/neo和CNE1/CR-1+細(xì)胞的蛋白質(zhì)組雙向凝膠電泳分析. 結(jié)論:

16、 1.相對(duì)于鼻咽永生化上皮細(xì)胞NP69和鼻咽慢性炎組織，Cripto-1在鼻咽癌細(xì)胞株和組織中表達(dá)上調(diào)，且與鼻咽癌的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)； 2. Cripto-1基因沉默后顯著抑制了鼻咽癌細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲能力；Cripto-1過(guò)表達(dá)后則明顯促進(jìn)了鼻咽癌細(xì)胞的體外增殖、遷移和侵襲能力。Cripto-1與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)； 3.2D-DIGE/MS分析所得的差異表達(dá)蛋白：DJ-1、1433G和ANXA3可能與

17、鼻咽癌中Cripto-1的作用相關(guān)。 本研究的創(chuàng)新之處： 1.在mRNA和蛋白水平證實(shí)Cripto-1在鼻咽癌細(xì)胞株和組織中表達(dá)上調(diào)，且與鼻咽癌的侵襲與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；為進(jìn)一步理解鼻咽癌發(fā)病的分子機(jī)制和尋找新的早期診斷與分子靶向治療靶點(diǎn)提供新線索。 2.構(gòu)建了Cripto-1敲低的慢病毒載體，建立了穩(wěn)定的Cripto-1過(guò)表達(dá)和敲低的相關(guān)細(xì)胞克??；為進(jìn)一步了解Cripto-1在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用及其機(jī)制提供