用基因芯片技術(shù)分析川芎嗪對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的影響.pdf

1、本文論述了以基因芯片技術(shù)分析川芎嗪對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的影響。 炎癥性腸?。↖BD）包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩?。–D），是免疫、遺傳、環(huán)境及腸道細(xì)菌等多因素、多環(huán)節(jié)相互作用的結(jié)果，由于病因不明,臨床上常常表現(xiàn)反復(fù)發(fā)作而治愈難度大。近年來(lái)在CD的治療研究上取得了較大的進(jìn)展，幾種特異性免疫生物制劑的療效相繼得到肯定。與此同時(shí)，對(duì)在我國(guó)發(fā)病率更高的UC的研究卻大大滯后，一方面原因在于UC的動(dòng)物模型制取不易，本實(shí)驗(yàn)選用惡唑酮結(jié)腸炎

2、模型,為 Th2型炎癥,其組織學(xué)特征和炎癥分布均類似人類。另一方面，雖然在運(yùn)用某些特異性免疫生物制劑包括中醫(yī)藥手段來(lái)干預(yù)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)以治療UC上也有很多嘗試，但檢測(cè)指標(biāo)多集中于單一或數(shù)個(gè)分子上，取材種類也較少，從而使得數(shù)據(jù)較為單薄，難以完整解釋藥物的作用機(jī)制。 本實(shí)驗(yàn)采用基因芯片表達(dá)譜技術(shù)分析川芎嗪對(duì)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎的影響，對(duì)川芎嗪藥物的作用機(jī)制做出綜合評(píng)價(jià)，旨在進(jìn)一步了解潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制及提高中藥療效提供有益的思路，為U

3、C的動(dòng)物模型選取和藥物篩選研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1.建立小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型及川芎嗪體內(nèi)藥物干預(yù)。將40只健康昆明小鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組（10只）、模型對(duì)照組（10只）、生理鹽水組（10只）、川芎嗪組（10只）；除正常組外，其他動(dòng)物均建立惡唑酮誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型：小鼠背部皮膚滴注3％惡唑酮（溶解于100％乙醇中）0.2mL；1d后重復(fù)滴注1次。4d后將硅膠管從肛門插入小鼠腸道深約4cm,注入0.5％惡唑酮（溶解

4、于50％乙醇中）0.15mL。灌腸后第2d起對(duì)3組動(dòng)物分別不處理、腹腔注射生理鹽水100ul和川芎嗪8mg/kg（以100ul生理鹽水稀釋）。連續(xù)治療7d后處死所有動(dòng)物。取離體新鮮結(jié)腸組織， -80℃保存。 2.結(jié)腸組織大體形態(tài)和組織學(xué)評(píng)分。取各組小鼠肛門至盲腸段結(jié)腸(約8cm)沿腸結(jié)膜縱軸剪開,冷生理鹽水沖洗干凈, 用放大鏡觀察大體形態(tài)改變,按無(wú)損傷0分,黏膜充血1分,潰瘍面積≤受損面積25％ 2分,潰瘍面積為受損面積25％～

5、50％ 3分,潰瘍面積≥受損面積50％ 4分,為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。取腸組織一部分以10％福爾馬林固定,石蠟包埋,HE染色鏡下評(píng)價(jià)炎癥和潰瘍,結(jié)腸組織學(xué)損傷評(píng)分指標(biāo)包括潰瘍、肉芽腫,纖維化按有無(wú)及輕重計(jì)為0、1、2分,病變深度(達(dá)粘膜下層1分、肌層2分、漿膜層3分),各項(xiàng)相加得總分。 3.小鼠基因芯片實(shí)驗(yàn)方法。小鼠結(jié)腸樣本總RNA抽提按TRIZOL RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取各樣本總RNA，取等量結(jié)腸組織RNA分別于組內(nèi)混合。用瓊脂糖凝膠

6、電泳及Lab-on-chip系統(tǒng)對(duì)樣品總RNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)和定量。 探針制備： 采用QIAGEN Rneasya Kit（QIAGEN公司，Cat No.74106）分離純化總RNA。mRNA經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄標(biāo)記cDNA探針并純化，cDNA第一鏈和第二鏈一步法合成，參入熒光標(biāo)記NTP，用Cy3-NTP標(biāo)記鹽水對(duì)照組結(jié)腸cDNA，用Cy5-NTP標(biāo)記川穹嗪組結(jié)腸cDNA。 芯片雜交和掃描采用小鼠基因芯片為Mouse ol

7、igo microarray（Agilent公司，目錄號(hào)：G4112A）。芯片的雜交、洗脫、染色均在Agilent公司專用設(shè)備Agilent雜交爐（型號(hào):G2545A）中完成。用Agilent激光共聚焦掃描儀（型號(hào):G2655AA）對(duì)雜交結(jié)束后的芯片進(jìn)行掃描。 數(shù)據(jù)讀取與標(biāo)準(zhǔn)化處理圖像直接使用Agilent系統(tǒng)相應(yīng)的圖像分析軟件Feature Extraction進(jìn)行定量分析處理。通過(guò)對(duì)熒光、背景和標(biāo)準(zhǔn)化方式（Linear&Lo

8、wess）等參數(shù)的設(shè)定，圖像定量和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理一步完成。Ratio值為cy3/cy5，差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為Ratio(Cy3/Cy5)>=2或<=0.5，F(xiàn)lag為0，SN>2.6，pValueLogRatio<0.05。最后使用genespring和cluster分析軟件進(jìn)行基因聚類分析。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)均以統(tǒng)計(jì)軟件SPSSV13.0進(jìn)行處理分析，大體評(píng)分和組織學(xué)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，大體評(píng)分和組織學(xué)評(píng)分采用成

9、組設(shè)計(jì)的兩樣本均數(shù)比較的t檢驗(yàn), ,定義P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.模型制備結(jié)果模型組大體評(píng)分 2.62±0.29，組織學(xué)評(píng)分7.94±0.45；正常組大體評(píng)分0.18±0.24，組織學(xué)評(píng)分2.60±1.23，模型組評(píng)分較對(duì)照組評(píng)分增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）符合潰瘍性結(jié)腸炎的特征，提示：小鼠UC模型制備成功。 2.結(jié)腸組織大體形態(tài)和組織學(xué)評(píng)分生理鹽水組大體評(píng)分2.04±0.11，組織

10、學(xué)評(píng)分7.01±0.05；川芎嗪組大體評(píng)分1.25±0.59，組織學(xué)評(píng)分3.55±0.29，川芎嗪組用藥7d后可見粘膜充血水腫減輕,潰瘍愈合,腺體增生明顯,鏡下黏膜及黏膜淺層僅有少量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),大體評(píng)分和組織學(xué)評(píng)分低于生理鹽水組（P<0.05）。 3.差異表達(dá)基因Mouse oligo microarray芯片總點(diǎn)樣數(shù)1,2012個(gè)點(diǎn), 根據(jù)Signal log ratio值排列并結(jié)合基因的生物學(xué)功能以及 Tree

11、view分析,待研基因包含細(xì)胞因子、炎性因子、離子通道和運(yùn)輸?shù)鞍谆?、?xì)胞周期蛋白基因、細(xì)胞骨架和運(yùn)動(dòng)蛋白基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白基因、免疫相關(guān)基因、細(xì)胞信號(hào)和傳遞蛋白、代謝基因、蛋白翻譯合成基因、、細(xì)胞骨架與動(dòng)力蛋白基因等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與生理鹽水對(duì)照組相比，川芎嗪治療組差異表達(dá)基因486個(gè)，占芯片基因總數(shù)2.86％，其中上調(diào)基因335個(gè)，下調(diào)基因151個(gè)，其中部分已知基因的功能，表明川芎嗪可以引起多種基因表達(dá)發(fā)生改變, 通過(guò)多方面作用

12、途徑在理論上為治療潰瘍性結(jié)腸炎提供了可能，但該類藥物更為精細(xì)的治療靶點(diǎn)都有待于進(jìn)一步探索。 結(jié)論： 1.川芎嗪通過(guò)抗炎癥介質(zhì)，抑制腸道炎癥反應(yīng)；保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，改善微循環(huán)；抗黏附分子；修復(fù)腸道細(xì)胞的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)、抗黏附分子及改善免疫功能等多方面作用途徑在理論上為治療潰瘍性結(jié)腸炎提供了可能，但該類藥物更為精細(xì)的治療靶點(diǎn)都有待于進(jìn)一步探索。 2.基因芯片技術(shù)在藥物作用的分子機(jī)理、藥物活性等領(lǐng)域都有其他方法無(wú)可比擬的優(yōu)越