E-鈣黏素和β-連環(huán)蛋白在小鼠角膜上皮損傷修復(fù)中的表達(dá)變化和黏附增殖作用.pdf

1、目的:通過角膜上皮刮除，建立角膜損傷模型，探討E-cadherin和β-catenin在小鼠角膜創(chuàng)傷愈合過程中的表達(dá)變化和對(duì)創(chuàng)傷愈合的作用，并對(duì)兩者之間的相互作用及與此可能相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路做初步研究。 方法:選擇6．8周的C57BL/6J小鼠，通過刮除角膜上皮，制作角膜損傷模型。將角膜損傷后的小鼠根據(jù)時(shí)間隨機(jī)分成7組，分別為損傷后3h、6h、9h、12h、18h、24h和48h組。對(duì)角膜進(jìn)行熒光素染色，在裂隙燈下觀察、照相，并

2、用Leica QWin軟件計(jì)算角膜損傷面積。光、電鏡下觀察角膜組織結(jié)構(gòu)。AE5免疫熒光染色，并結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，對(duì)角膜上皮刮傷修復(fù)過程中的細(xì)胞進(jìn)行系統(tǒng)的觀察與分析。用RT-PCR和免疫熒光染色檢測(cè)正常小鼠角膜組織中E-cadherin和β-catenin的表達(dá)。通過Real-time PCR和Western Blot方法檢測(cè)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)E-cadherin和β-catenin的mRNA、全蛋白和胞漿蛋白表達(dá)變化情況。采用免疫熒光染色法

3、檢測(cè)β-catenin和磷酸化β-catenin(Ser33/37/Thr41)分布特點(diǎn)。Real-time PCR檢測(cè)Cx43的表達(dá)變化，RT-PCR檢測(cè)PCNA及Cyclin D1的mRNA表達(dá)情況。 結(jié)果:熒光素染色、HE和電鏡顯示角膜上皮刮除后6h，細(xì)胞開始遷移，創(chuàng)口損傷面積開始顯著減小，到24h創(chuàng)口基本再上皮化，48h上皮形態(tài)和連接結(jié)構(gòu)恢復(fù)到正常。AE5熒光染色顯示覆蓋創(chuàng)口區(qū)域的細(xì)胞均呈陽性免疫反應(yīng)。流式細(xì)胞術(shù)可見凋亡

4、率在6h達(dá)到最高值，以后凋亡率逐漸下降，至損傷后24h基本趨于正常。細(xì)胞周期分析示S期細(xì)胞在9h開始增多，至24h達(dá)到頂峰，觀察的24h內(nèi)只發(fā)生一次增殖。E-cadherin和β-catenin mRNA在正常小鼠角膜中有表達(dá)。免疫熒光染色顯示E-cadherin主要表達(dá)在角膜上皮細(xì)胞胞膜，β-catenin在角膜的上皮、基質(zhì)和內(nèi)皮層均有表達(dá)。Real-time PCR顯示，損傷后3h E-cadherin和β-catenin表達(dá)均升高

5、，并達(dá)最高，之后持續(xù)下降。Western Blot顯示，E-cadherin蛋白在損傷后3h～18h均比正常低，至24h表達(dá)開始增多，48h蛋白表達(dá)明顯增多。β-catenin全蛋白在損傷后3h到12h表達(dá)沒有明顯變化，18h到48h蛋白表達(dá)增多。β-catenin胞漿蛋白在6h和9h增多后，12h和18h減少，至24h和48h又增多。磷酸化β-catenin(Ser33/37/Thr41)損傷后6h表達(dá)呈陽性，9h上皮細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)，細(xì)

6、胞質(zhì)呈強(qiáng)染，損傷后18h至48h恢復(fù)到正常水平。β-catenin在損傷后18h起至48h角膜上皮細(xì)胞紅色熒光增強(qiáng)，并且出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核表達(dá)。Real-time PCR顯示，Cx43在損傷后6h表達(dá)開始明顯下降，12h降到最低點(diǎn)，18h至48h開始持續(xù)上升。RT-PCR顯示，PCNA mRNA表達(dá)水平在損傷后3h就開始明顯下降，6h達(dá)最低點(diǎn)，9h開始有所升高，48h達(dá)正常水平。Cyclin D1 mRNA表達(dá)水平在損傷后3h下降，12

7、h稍有所上升，18h～24h又下降，48h上升達(dá)正常水平。 結(jié)論:制作的小鼠角膜上皮刮除模型損傷面積較均一，具有可重復(fù)性，角膜上皮能完全修復(fù)，模型制作成功，能用于對(duì)角膜上皮損傷修復(fù)過程的研究。整個(gè)修復(fù)過程經(jīng)歷細(xì)胞遷移覆蓋創(chuàng)面，上皮化后細(xì)胞增殖，再復(fù)層化。在損傷早期能引起E-cadherin和β-catenin mRNA表達(dá)增加，損傷晚期E-cadherin和β-catenin蛋白合成增加。E-cadherin在損傷早期蛋白表達(dá)降