1，3-丁二烯職業(yè)暴露人群HPRT基因分子突變機(jī)理的初步研究.pdf

1、人類的生存空間中存在著大量的有害外來化合物(包括物理的、化學(xué)的與生物的),可能損害人類的遺傳物質(zhì)(染色體、基因與DNA等),誘發(fā)高頻率的突變,進(jìn)而對(duì)人類健康和物種品質(zhì)構(gòu)成危害.HPRT基因正向突變?cè)囼?yàn)是國(guó)內(nèi)外廣泛采用的突變檢測(cè)方法.以往進(jìn)行HPRT基因的致突變檢測(cè)主要有兩種方法,即放射自顯影法與多核細(xì)胞檢測(cè)法,雖然這兩種方法簡(jiǎn)單、快速,但主要的缺陷是不能進(jìn)一步確定突變細(xì)胞的來源(基因突變的定位與定性),這一直是制約HPRT基因突變研究深

2、入發(fā)展的重要因素.突變克隆檢測(cè)法由于克服了前兩種方法的主要缺陷而得到日益廣泛的應(yīng)用,已成為人類HPRT位點(diǎn)研究的最有價(jià)值的方法.因此選擇合適的方法"證實(shí)人類HPRT基因突變資料和獲取其分子突變譜"已成為今后致突變研究的"最緊迫的任務(wù)之一".通過運(yùn)用上述各種基因突變檢測(cè)技術(shù),國(guó)際上已積累了大量的有關(guān)HPRT基因位點(diǎn)突變的資料,并構(gòu)建了初步的HPRT位點(diǎn)突變圖譜數(shù)據(jù)庫,國(guó)際組織多次倡導(dǎo)進(jìn)行各種可疑誘變物對(duì)不同細(xì)胞系在體內(nèi)或體外的致突變檢測(cè),

3、收集盡可能多的HPRT突變圖譜資料,匯集成數(shù)據(jù)庫,為進(jìn)一步研究突變機(jī)理、突變熱點(diǎn)以及體內(nèi)外突變圖譜的比較打下基礎(chǔ).另一方面,1,3-丁二烯(BD)是一種重要的工業(yè)原料,廣泛用于合成橡膠、塑料等石油化工與制造行業(yè)中.由于發(fā)現(xiàn)BD在汽車尾氣、香煙煙霧以及食用油油煙中普遍存在,因此BD污染危害可能已超出了職業(yè)性范圍.考慮到在很低的暴露水平下(13.75mg/m<'3>)就能引起實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生腫瘤,美國(guó)最近再次把BD的職業(yè)暴露閾值從22mg/m<

4、'3>降至2.2mg/m<'3>,而我國(guó)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)定為100mg/m<'3>(1979年),提示現(xiàn)行的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)已不足以保護(hù)工人及其后代的健康.目前認(rèn)為BD對(duì)動(dòng)物體細(xì)胞和生殖細(xì)胞均有致突變作用,并且是肯定的動(dòng)物致癌物,但迄今為止,有關(guān)BD對(duì)人的致突變研究報(bào)告很少,且存在爭(zhēng)議.因此,本課題首先以幾種理化因素為模型在實(shí)驗(yàn)室建立起HPRT基因突變分析方法,然后利用現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)研究相結(jié)合,以74例BD暴露組工人與157例對(duì)照組

5、人群為對(duì)象,測(cè)定了工作場(chǎng)所空氣中BD含量,調(diào)查受試者一般健康和生活習(xí)慣背景,并進(jìn)行了職業(yè)健康檢查;通過對(duì)其外周血淋巴細(xì)胞克隆培養(yǎng),測(cè)定了231例受試者細(xì)胞克隆效率與HPRT基因突變頻率;利用多重PCR技術(shù)對(duì)783個(gè)HPRT基因突變體9個(gè)外顯子的缺失情況進(jìn)行了分析,并進(jìn)一步采用RT-PCR與cDNA測(cè)序研究了146個(gè)點(diǎn)突變體,初步探討了BD暴露組工人與對(duì)照組人群HPRT基因的分子突變譜及其相關(guān)機(jī)理.研究?jī)?nèi)容包括三部分:(1)以幾種理化因素

6、為模型在實(shí)驗(yàn)室建立HPRT基因突變分析方法;(2)BD生產(chǎn)車間作業(yè)工人職業(yè)暴露監(jiān)測(cè)及相關(guān)健康檢查;(3)BD作業(yè)工人淋巴細(xì)胞HPRT基因突變頻率及分子突變譜的實(shí)驗(yàn)研究,主要結(jié)果如下:1.根據(jù)我們的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查,并參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究資料,總結(jié)出選擇BD職業(yè)暴露現(xiàn)場(chǎng)的4條標(biāo)準(zhǔn)與2個(gè)參考因素,應(yīng)用于本次研究中,選定符合試驗(yàn)要求、具有代表性的BD生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng):南京揚(yáng)子石化公司烯烴廠BD車間;現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查BD車間生產(chǎn)工藝與作業(yè)工人工作流程,結(jié)合受試對(duì)象一般健

7、康與生活習(xí)慣背景資料,選擇BD暴露組與對(duì)照組,確定空氣監(jiān)測(cè)采樣點(diǎn),測(cè)定BD含量,暴露組工作地點(diǎn)BD含量為20.79±34.95mg/m3,而對(duì)照組工作地點(diǎn)均低于檢測(cè)下限.本研究方法也可供其它職業(yè)接觸化合物現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查時(shí)借鑒.2.受試對(duì)象職業(yè)健康檢查發(fā)現(xiàn),在涉及神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及生殖系統(tǒng)的主訴癥狀方面,BD暴露組明顯高于對(duì)照組(P<0.05);血液學(xué)檢查方面,BD暴露組血紅蛋白明顯低于對(duì)照組(P<0.05),并且紅細(xì)胞計(jì)數(shù)也下降;特殊檢查

8、方面,BD暴露組的心電圖異常比例明顯高于對(duì)照組(P<0.05),主要表現(xiàn)為"T波低平".結(jié)果提示,BD對(duì)職業(yè)暴露人群具有一定的毒性作用,其臨床表現(xiàn)是多方面的,可能在人體內(nèi)存在多種靶器官和組織.3.測(cè)定了74例BD作業(yè)工人與157例對(duì)照人群的外周血淋巴細(xì)胞克隆效率與突變頻率,BD暴露組的細(xì)胞克隆效率沒有變化,但突變頻率(18.24±9.35×10<'-6>)比對(duì)照組(12.74±7.33×10<'-6>)升高.盡管本次實(shí)驗(yàn)對(duì)照組與其它同類

9、研究對(duì)照組相比,突變頻率較高,造成本實(shí)驗(yàn)兩組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不顯著,但仍具有實(shí)際意義,提示BD對(duì)人具有潛在的致突變作用.可以推測(cè)國(guó)際上對(duì)此問題的爭(zhēng)論可能主要來自對(duì)照組選擇的不同.4.本試驗(yàn)測(cè)定了415個(gè)對(duì)照組突變體與368個(gè)BD暴露組突變體,對(duì)照組突變體中大多數(shù)是點(diǎn)突變(87.5﹪),其比例高于BD暴露組(72.6﹪);但BD暴露組工人外顯子缺失發(fā)生頻率(27.4﹪)明顯高于對(duì)照人群(12.5﹪)(P<0.05),其中主要是多外顯子連鎖缺

10、失比例升高(P<0.05).結(jié)果表明在外顯子水平BD接觸對(duì)職業(yè)人群具有明確的致突變作用.5.本試驗(yàn)對(duì)71個(gè)來自對(duì)照組的突變體與75個(gè)來自BD暴露組的突變體進(jìn)行了序列分析,BD暴露組單堿基置換發(fā)生率(61.3﹪)明顯低于對(duì)照組(80.3﹪),但其中A:T→T:A 顛換發(fā)生率反而明顯高于對(duì)照組(P<0.05).BD暴露組±1移碼突變發(fā)生率(22.7﹪)也明顯高于對(duì)照組(7.0﹪).結(jié)果顯示BD暴露組與對(duì)照組在堿基突變譜總體上也存在明顯差別.

11、6.測(cè)序中發(fā)現(xiàn)1個(gè)新的HPRT基因突變位點(diǎn):73位點(diǎn),并在3個(gè)已知突變位點(diǎn)上觀察到新的突變類型:149(C→T)、395(T→A)與430(C→T)位點(diǎn),但這些突變可能是自發(fā)突變事件,而與BD暴露無關(guān).這些結(jié)果是首次報(bào)導(dǎo),還需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證.7.體內(nèi)與體外試驗(yàn)突變譜比較HPRT基因突變位點(diǎn)在各個(gè)外顯子中的分布,未發(fā)現(xiàn)突變熱點(diǎn),但均有明顯的區(qū)域分布特點(diǎn),3'端出現(xiàn)突變的數(shù)目要高于中段與5'端.這可能與HPRT基因9個(gè)外顯子不同的結(jié)構(gòu)與功

12、能密切相關(guān).目前對(duì)于外來化合物誘導(dǎo)HPRT基因突變是否有"熱點(diǎn)"的問題存在爭(zhēng)議.本研究的結(jié)果表明,由于外顯子在基因DNA結(jié)構(gòu)上的不均勻分布(偏向于3'端),因此這種爭(zhēng)議可能不是來源于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不同,而是比較方法的不同造成的,對(duì)于這個(gè)突變熱點(diǎn)問題以及相關(guān)分子機(jī)理下結(jié)論還為時(shí)過早,有待進(jìn)一步深入研究.8.本研究以幾種理化因素為模型,在實(shí)驗(yàn)室成功建立起克隆篩檢法結(jié)合多重PCR技術(shù)的HPRT基因突變分析方法,不僅能進(jìn)行常規(guī)的HPRT基因突變細(xì)胞

13、克隆效率與突變頻率的分析,而且能進(jìn)一步擴(kuò)增突變細(xì)胞,進(jìn)行深入的分子突變譜研究,再加上必要的測(cè)序工作,那么本方法作為一種深入、系統(tǒng)地研究外來化合物的致突變性及其分子突變機(jī)理的方法,不僅為開展BD職業(yè)暴露人群HPRT基因突變分析奠定了方法學(xué)基礎(chǔ),而且具有廣泛的應(yīng)用前景.總之,通過課題的研究,不僅在分子水平上系統(tǒng)地獲得BD對(duì)人具有致突變性的證據(jù),而且為我國(guó)重新制定BD職業(yè)暴露衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)以及職業(yè)防護(hù)提供了理論依據(jù);從更大范圍來說,本研究的結(jié)果將使