PCR-ACRS法篩查成年漢族人CYP21基因P459H的突變位點(diǎn).pdf

1、目的： 先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥(CAH)是一種較常見的常染色體隱性遺傳病，由21-羥化酶缺陷引起者約占90％～95％。此酶由21-羥化酶基因編碼，缺乏可引起皮質(zhì)醇合成不足以及前體底物堆積。主要臨床表現(xiàn)是性發(fā)育畸形：女性患者外生殖器男性化，男性患者出現(xiàn)假性性早熟。21-羥化酶基因位于人類6號(hào)染色體短臂6p21.3組織相容性抗原Ⅲ(HLAⅢ)基因區(qū)，由無活性的假基因(CYP21P)和有活性的真基因(CYP21)串聯(lián)排列組成。大約95

2、％的CYP21基因突變是由于真假基因相互作用引起，其余5％的患者等位基因含有特別的突變。迄今已發(fā)現(xiàn)80余種CYP21基因突變導(dǎo)致21-羥化酶缺陷癥(21-OHD)，目前國(guó)內(nèi)僅是對(duì)較常見的9個(gè)突變進(jìn)行檢測(cè)，尚未見新的基因突變報(bào)道。我們?cè)谇捌诠ぷ髦惺占?個(gè)21-OHD家系，采用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序的方法，對(duì)患者及其家系進(jìn)行基因突變分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道的新突變P459H(即外顯子10第459位密碼子CCC突變?yōu)镃AC，導(dǎo)致編碼

3、蛋白質(zhì)上相應(yīng)的脯氨酸變?yōu)榻M氨酸)。為進(jìn)一步驗(yàn)證該基因突變確實(shí)屬于點(diǎn)突變，而非基因多態(tài)，本研究采用PCR結(jié)合擴(kuò)增引進(jìn)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)(PCR-ACRS)的方法對(duì)100名正常成年漢族人該位點(diǎn)進(jìn)行分析。 方法： 1例CAH患者，社會(huì)性別為女性，通過臨床表現(xiàn)，皮質(zhì)醇、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、17-羥孕酮(17-OHD)、睪酮(T)等激素測(cè)定和影像學(xué)檢查確立診斷。100例正常成年漢族人從山東大學(xué)齊魯醫(yī)院健康查體中心隨機(jī)選

4、取，平均年齡(28±5)歲，其中男性52例，女性48例。相互之間無親緣關(guān)系，排除CAH家族史。 取受檢者外周靜脈血2ml，EDTA-K2抗凝。抽提基因組DNA，根據(jù)真假基因序列的差別，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增CYP21基因3～10外顯子，Pst Ⅰ限制性內(nèi)切酶消化驗(yàn)證PCR產(chǎn)物為特異性擴(kuò)增。應(yīng)用PCR-ACRS方法擴(kuò)增所有樣本的首次PCR產(chǎn)物，F(xiàn)sp Ⅰ限制性內(nèi)切酶酶切后用10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)篩查P459H變異的

5、發(fā)生率。 結(jié)果： 1．首次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物即CYP21基因第3～10外顯子用Pst Ⅰ限制性內(nèi)切酶酶切，由于真假基因上Pst Ⅰ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)數(shù)目不同，造成酶切片段大小不同，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可以鑒別真假基因，經(jīng)Pst Ⅰ限制性內(nèi)切酶證實(shí)所擴(kuò)增的均為真基因序列。 2．患者CYP21基因第10外顯子攜帶P459H變異(CCC→CAC)，100例正常成年漢族人CYP21基因第10外顯子密碼子459均為CC