聚乳酸聚乙醇酸-RNAⅢ抑制肽緩釋微球的制備和預防骨科內(nèi)植物葡萄球菌感染的實驗研究.pdf

1、目的： 骨科內(nèi)植物感染一直是個棘手的問題，人工關節(jié)置換術后感染更是災難性的并發(fā)癥，治療也更具挑戰(zhàn)性。骨科內(nèi)植物感染以產(chǎn)生物被膜的金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌引起的慢性感染最為常見，由于細菌耐藥問題越來越嚴重，所以迫切需要更加有效的方法來治療耐藥菌引起的骨科內(nèi)植物尤其是人工關節(jié)感染。研究證明RIP可以抑制所有葡萄球菌菌株的毒性，是一種作用機制不同于傳統(tǒng)抗菌素的全新制劑，本研究采用固相合成法、反相液相色譜法合成并提純得到高純度RIP

2、，改良復乳-溶劑揮發(fā)法制備PLGA/RIP緩釋微球，分析其表征；體外研究PLGA/RIP緩釋微球的洗提學特征和抑菌活性，并對PLGA/RIP緩釋微球的組織相容性和血液相容性進行評價；在前期實驗的基礎上建立全新的兔膝關節(jié)置換術后慢性感染的模型，以期真實模擬-臨床上常見的慢性感染，研究PLGA/RIP緩釋微球在體內(nèi)預防表皮葡萄球菌造成的兔膝關節(jié)置換術后慢性感染的效果。 方法： 1、PLGA/RIP緩釋微球的構建和體外洗提學研

3、究：根據(jù)已知的氨基酸序列，采用固相合成法合成RIP粗品，利用反相高效液相法對RIP粗品進行純化，對純化后的RIP肽進行質(zhì)譜分析、氨基酸組成分析、氨基酸序列分析和紅外光譜分析．采用改良復乳-溶劑揮發(fā)法制備PLGA/RIP緩釋微球，觀察其表征，測定緩釋微球的載藥率和包封率．采用高效液相色譜法測定不同時點不同濃度PLGA/RIP洗提液的pH值變化，RIP的釋放速度、累積釋放量和洗提液中RIP的濃度，觀察PLGA/RIP微球的體外釋藥特點。通過

4、PLGA/RIP緩釋系統(tǒng)對金黃色葡萄球菌ATCC25923的抑制，測定其有效抑菌環(huán)直徑，比較不同時點洗提液抑菌環(huán)直徑大小，判斷不同濃度洗提液抑菌活性大小． 2，體外研究PLGA/RIP緩釋微球的血液相容性和組織相容性：選擇溶血實驗、凝血實驗、血小板聚集實驗，測定凝血酶原時間和活化部分凝血酶時間、觀察PLGA/RIP緩釋微球?qū)ν冒准毎?、紅細胞和血小板的影響，對PLGA/RIP血液相容性進行評價．選擇急性全身毒性試驗、MTT細胞毒性

5、試驗、肌肉內(nèi)植入試驗、過敏試驗和熱源試驗，對聚乳酸乙醇酸/RNAⅢ抑制肽緩釋微球的組織相容性進行評價。 2、PLGA/RIP緩釋微球預防兔膝關節(jié)置換術后葡萄球菌慢性感染的實驗研究：在前期實驗的基礎上建立全新的兔膝關節(jié)置換術后慢性感染的模型，測定白細胞、C-反應蛋白、病理學檢查、掃描電鏡觀察和激光共聚焦掃描檢查，研究PLGA/RIP緩釋微球在體內(nèi)預防表皮葡萄球菌造成的兔膝關節(jié)置換術后慢性感染的效果。 結(jié)果： 1、P

6、LGA/RIP緩釋微球的構建和體外洗提學研究：采用固相合成的方法可以合成得到穩(wěn)定的RIP，經(jīng)反相高效液相法純化可得到純度為96.8％的多肽，通過質(zhì)譜分析、氨基酸組成分析、氨基酸序列分析、傅立葉紅外光譜分析顯示本研究中合成的RIP具有和天然RIP相同的氨基酸組成乖序列結(jié)構。采用改良復乳-溶劑揮發(fā)法制備的PLGA/RIP緩釋微球粒徑均勻、表面光滑，包封率約為(68.22±6.20)％，載藥率為(15.35±3.26)％．PLGA/RIP前1

7、2小時釋藥動力學方程為y=3.8507x+10.193，30天累積釋藥動力學方程為y=31.016x+59.611，均符合Huguchi方程，是較為理想的緩釋載藥體系．體外抑菌實驗表明PLGA/RIP緩釋微球具有抑菌活性。 2、PLGA/RIP緩釋微球的血液相容性和組織相容性研究：溶血實驗、凝血實驗和血小板聚集實驗，凝血酶原時間和活化部分凝血酶時間測定證實了PLGA/RIP緩釋微球?qū)ν玫娜苎?。凝血時間、血小板聚集以及白細胞、紅細

8、胞和血小板地數(shù)量均無明顯影響，具有良好的血液相容性；急性毒性試驗、MTT細胞毒性試驗、肌肉內(nèi)植入試驗、過敏試驗及熱原試驗證實了PLGA/RIP緩釋微球不引起全身毒性反應，無細胞毒性，未見免疫排斥，不引起過敏反應，無熱源性，具有良好的組織相容性和安全性。 3、PLGA/RIP緩釋微球預防兔膝關節(jié)置換術后葡萄球菌慢性感染的實驗研究：通過白細胞計數(shù)、C-反應蛋白、病理學檢查、熒光顯微鏡、掃描電鏡和激光共聚焦掃描證實，術后兔膝關節(jié)每天注

9、入1×102CFU的表皮葡萄球菌ATCC35984菌液0.25mL最終會導致實驗動物發(fā)生慢性感染，而PLGA/RIP緩釋微球在局部持續(xù)釋放，可以預防持續(xù)存在的小劑量致病菌造成的兔膝關節(jié)置換術后慢性感染。 結(jié)論： 采用固相合成法和反相高效液相色譜法可以制備高純度的RIP，合成的RIP具有與天然RIP相同的結(jié)構組成和抑菌活性；采用改良復乳-溶劑揮發(fā)法制備的PLGA/RIP緩釋微球粒徑均勻、表面光滑，包封率和載藥率較高，體外釋