一個(gè)來自于稻瘟病菌的免疫誘導(dǎo)蛋白的鑒定和功能分析.pdf

1、植物在一定的誘導(dǎo)因子(又稱激發(fā)子)作用下，產(chǎn)生對(duì)隨后病原菌侵染的抗性增強(qiáng)，這種現(xiàn)象稱為誘導(dǎo)免疫(induced immunity)。激發(fā)子本身沒有殺菌活性，但可以通過活化植物體內(nèi)的免疫機(jī)制從而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性。近年來，一些微生物來源的蛋白類免疫誘導(dǎo)因子引起人們的廣泛關(guān)注。這類激發(fā)子對(duì)植物無(wú)毒、作用劑量小、環(huán)境友好，因而在開發(fā)環(huán)境友好型作物病害免疫誘導(dǎo)劑中具有廣闊前景。本項(xiàng)目從稻瘟病菌中分離鑒定了1個(gè)免疫誘導(dǎo)蛋白基因MgSM1，采用農(nóng)桿菌

2、介導(dǎo)的瞬間表達(dá)技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究了MgSM1蛋白的免疫誘導(dǎo)活性及其可能的機(jī)理。 根據(jù)其他微生物中SM1基因的序列信息，采用生物信息學(xué)方法克隆了稻瘟病菌的SM1基因cDNA，命名為MgSM1。MgSM1包含一個(gè)414bp的ORF，編碼一個(gè)138個(gè)氨基酸的蛋白，含有一個(gè)高度保守的Cerato-platanin(CP)的4個(gè)半胱氨酸二硫鍵。RT-PCR分析表明，MgSM1在稻瘟病菌侵染水稻過程中有明顯的表達(dá)；另外MgSM1基因在稻

3、瘟菌的整個(gè)生活史中都有表達(dá)。 為了研究MgSM1蛋白的免疫誘導(dǎo)活性，將MgSM1的ORF序列克隆到pFLAG-CTS1質(zhì)粒上，形成C-末端與FLAG序列融合的重組蛋白，并將整個(gè)MgSM1-FLAG構(gòu)建克隆進(jìn)由DEX誘導(dǎo)表達(dá)型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)的pINDEX3雙元質(zhì)粒中。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)瞬間表達(dá)方法，分析了MgSM1在普通煙、本氏煙、番茄、擬南芥和水稻等不同植物上的免疫誘導(dǎo)活性。結(jié)果表明，在農(nóng)桿菌注射并經(jīng)DEX誘導(dǎo)處理后，供試植

4、物在短時(shí)間內(nèi)(處理后6小時(shí))注射葉片組織發(fā)生過敏性反應(yīng)(hypersensitivity response，HR)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，組織崩潰。在普通煙、本氏煙、番茄、擬南芥和水稻等植物葉片上，MgSM1的瞬間表達(dá)可引起注射葉片中活性氧的產(chǎn)生，注射葉片的電導(dǎo)率升高，HR指示基因表達(dá)增強(qiáng)。這些結(jié)果說明，MgSM1可以在多種植物上引起HR反應(yīng)。 為了明確MgSM1處理后，不同植物植株是否激活體內(nèi)防衛(wèi)反應(yīng)并提高抗病性，分析了MgSM1處理

5、植株體內(nèi)防衛(wèi)基因的表達(dá)并測(cè)定了上部葉片的抗病性。RT-PCR結(jié)果表明，注射MgSM1并經(jīng)DEX誘導(dǎo)后，煙草、番茄、擬南芥和水稻植株的注射葉片PR基因表達(dá)上調(diào)，而且在注射葉片上部非注射葉片中PR基因也出現(xiàn)上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果說明，MgSM1作用后不僅激活了注射葉片局部組織的防衛(wèi)反應(yīng)，而且也活化了未處理葉片組織中的防衛(wèi)反應(yīng)?？共⌒詼y(cè)定結(jié)果顯示，在注射MgSM1并經(jīng)DEX誘導(dǎo)處理的番茄中，上部未處理葉片上接種灰霉菌(Botrytis ciner

6、ea)后，病害程度明顯低于對(duì)照；同樣，在注射MgSM1并經(jīng)DEX誘導(dǎo)處理的擬南芥植株中，上部葉片上接種B.cinerea和Pseudomonas syringae pv.tomato(Pst)DC3000后，灰霉病病害癥狀和B.cinerea的生長(zhǎng)量菌明顯低于對(duì)照，PstDC3000引起的病害癥狀和細(xì)菌菌量也明顯低于對(duì)照。這些結(jié)果說明，MgSM1作用后，通過激活植株體內(nèi)的防衛(wèi)基因表達(dá)，提高了植株對(duì)多種病害的抗病性。 為了進(jìn)一步研

7、究MgSM1在調(diào)控抗病反應(yīng)中的功能，本研究將MgSM1基因?qū)霐M南芥，經(jīng)抗性分離篩選和分子鑒定獲得3個(gè)單拷貝插入的過量表達(dá)MgSM1轉(zhuǎn)基因純合株系(＃2、＃7和＃11)。在未經(jīng)DEX處理時(shí)，MgSM1轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株無(wú)明顯形態(tài)和發(fā)育上的差異。在DEX處理后，能檢測(cè)到MgSM1的表達(dá)，而且高濃度DEX處理時(shí)植株生長(zhǎng)受到抑制，甚至死亡?？共⌒栽囼?yàn)表明，MgSM1轉(zhuǎn)基因擬南芥植株增強(qiáng)了對(duì)PstDC3000、B.cinerea和Alter

8、nariabrassicicola的抗性。接種PstDC3000后，MgSM1轉(zhuǎn)基因植株葉片中病害癥狀減輕，葉片中細(xì)菌數(shù)量比對(duì)照下降2個(gè)數(shù)量級(jí)；噴霧接種B.cinerea后，MgSM1轉(zhuǎn)基因植株病害明顯低于對(duì)照，B.cinerea生長(zhǎng)量也明顯低于對(duì)照；離體葉片接種A.brassicicola后，MgSM1轉(zhuǎn)基因植株葉片上病斑顯著減小。RT-PCR分析表明，MgSM1轉(zhuǎn)基因植株經(jīng)DEX處理后，防衛(wèi)基因如PR-1、PDF1-2和PR-5等的

9、表達(dá)明顯上調(diào)，對(duì)照植株中防衛(wèi)基因表達(dá)沒有變化。染色檢測(cè)表明，DEX處理后MgSM1轉(zhuǎn)基因植株葉片內(nèi)有顯著的過氧化氫和超氧陰離子等活性氧的產(chǎn)生與積累，而對(duì)照植株中則未檢測(cè)到活性氧的積累。這些結(jié)果證明，MgSM1作用后，能激活植株體內(nèi)防衛(wèi)基因表達(dá)，并提高植株對(duì)多種病害的抗病性。 為了探索MgSM1在誘導(dǎo)抗病反應(yīng)中可能涉及的信號(hào)途徑，比較了MgSM1在不同抗病信號(hào)突變體上誘導(dǎo)抗病反應(yīng)的變化。MgSM1在npr1、fls2-100、Na

10、hG、ein2和jar1-1等突變體植株葉片上引起的壞死反應(yīng)明顯強(qiáng)于其在野生型植株葉片上引起的壞死反應(yīng)。MgSM1在NahG、npr1、ein2和jar1-1突變體上誘導(dǎo)防衛(wèi)基因表達(dá)和抗病反應(yīng)能力下降，表明MgSM1的作用需要SA和JA/ET途徑的參與。但是，在fls2-100突變體中，MgSM1誘導(dǎo)防衛(wèi)基因表達(dá)和抗病反應(yīng)能力與在野生型中相似，說明MgSM1的作用不需要FLS2的參與。 為了明確MgSM1蛋白中的活性部位，構(gòu)建了

11、4個(gè)C-末端缺失的截?cái)嗥瑪喾肿覯gSM1-D1(缺失C端18個(gè)氨基酸)、MgSM1-D2(缺失C端38個(gè)氨基酸)、MgSM1-D3(缺失C端66個(gè)氨基酸)和MgSM1-D4(缺失C端84個(gè)氨基酸)，并用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬間表達(dá)方法分析了截?cái)喾肿拥拿庖哒T導(dǎo)活性。結(jié)果表明：在擬南芥上，MgSM1-D1和MgSM1-D2具有與MgSM1全長(zhǎng)片段相似的免疫誘導(dǎo)活性，并可誘導(dǎo)野生型擬南芥上的局部和系統(tǒng)性的PR基因表達(dá)，而MgSM1-D3和MgSM1-