DNA疫苗pSVK-CAVA宿主菌的篩選及其發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化研究.pdf

1、第一章DNA疫苗pSVK-CAVA高穩(wěn)定性宿主菌的篩選與鑒定
　　目的:從多種不同基因型的大腸桿菌中篩選出適合本研究大分子質(zhì)粒DNA疫苗的宿主菌，并建立三級種子庫。
　　方法:將質(zhì)粒pSVK-CAVA(14.7kb)轉(zhuǎn)化4種大腸桿菌化學感受態(tài)細胞并提取質(zhì)粒，通過瓊脂糖凝膠電泳實驗檢測質(zhì)粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)。對基因工程菌進行生化檢測，并通過連續(xù)傳代法和酶切鑒定進行穩(wěn)定性檢測，同時將質(zhì)粒DNA瞬時轉(zhuǎn)染至293T細胞中檢測質(zhì)粒表達能力。選

2、取質(zhì)粒含量最高和穩(wěn)定性最好的工程菌作為原始種子分裝凍存，將原始種子庫擴大培養(yǎng)，逐級建立好主種子庫和工作種子庫，即三級種子庫。
　　結(jié)果:確定了XL10-Gold作為質(zhì)粒DNA疫苗pSVK-CAVA的宿主菌，基因工程菌傳代穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性良好，工程菌生化特性未發(fā)生改變，質(zhì)粒能在293T細胞中體外表達，成功建立了達到中試要求的三級種子庫。
　　結(jié)論:大腸桿菌XL10-Gold適合作為質(zhì)粒DNA疫苗的宿主菌，解決了大質(zhì)粒在常用宿

3、主菌中不穩(wěn)定的難題。
　　第二章響應面法優(yōu)化質(zhì)粒DNA疫苗工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基
　　目的:篩選出基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并利用統(tǒng)計學方法對腫瘤疫苗工程菌發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化，提高質(zhì)粒DNA產(chǎn)量，降低成本。
　　方法:通過搖瓶試驗，利用單因素法對幾種備選基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行篩選，之后應用Plackett-Burman試驗設(shè)計方法和響應面法，對初始培養(yǎng)基7種組分配比進行優(yōu)化;利用Minitab軟件對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，并建立3種主要因素與質(zhì)

4、粒DNA產(chǎn)量之間的函數(shù)關(guān)系。將最終優(yōu)化的配方進行3次重復驗證實驗。
　　結(jié)果:篩選出TB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，質(zhì)粒容積產(chǎn)量達到9.9mg/L，比LB培養(yǎng)基提高了接近1倍。培養(yǎng)基3種主要因素的最佳濃度為:酵母提取物16.61g/L，甘油3.05ml/L，硫酸鎂0.185g/L，質(zhì)粒DNA產(chǎn)量能達到12.38mg/L。3次驗證實驗所測得的質(zhì)粒DNA產(chǎn)量平均能達到12.28mg/L，與預測結(jié)果基本一致。
　　結(jié)論:利用響應面法對腫瘤