轉(zhuǎn)錄因子Foxml維持干細胞多能性的研究.pdf

1、多能干細胞具有在體外無限擴增并保持未分化狀態(tài)的能力(自我更新)，且具有分化為機體中所有種類的細胞及形成嵌合體動物的能力(分化)。干細胞多能性維持受特定轉(zhuǎn)錄因子復雜網(wǎng)絡的調(diào)控。研究表明，轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Nanog、Sox2參與干細胞多能性維持并阻斷分化特異性基因的表達。Foxml是Fox轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，已有研究發(fā)現(xiàn)Foxml調(diào)控細胞增殖與DNA損傷修復，并參與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程。本文著重研究Foxml是否參與維持干細胞多能性及相關(guān)分子

2、機制：運用維甲酸(RA)誘導小鼠多能干細胞神經(jīng)分化模型，考察Foxml的表達水平與干細胞多能性的相關(guān)性，研究Foxml對干細胞多能性相關(guān)基因表達的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制，證實Foxml對干細胞多能性維持的重要生理功能。本文研究結(jié)果歸納如下：
　　一：P19EC細胞是研究Foxml參與干細胞多能性維持的良好干細胞體系。為確定P19EC細胞的多能性干細胞特性，我們首先證實P19EC干細胞能在裸鼠皮下形成畸胎癌，該畸胎癌具有三胚層來源組織結(jié)構(gòu)：外

3、胚層來源神經(jīng)組織、中胚層來源肌肉組織、內(nèi)胚層來源小腸上皮組織。同時，體外運用維甲酸誘導P19EC干細胞分化伴隨堿性磷酸酶活性的喪失。按標準化方法用維甲酸誘導P19EC干細胞發(fā)生神經(jīng)分化，RA誘導P19EC神經(jīng)分化經(jīng)歷三個階段：第一階段P19EC多能性喪失(0-24h)；第二階段變?yōu)樯窠?jīng)干細胞(1-3d)；第三階段P19EC分化為神經(jīng)元，星型膠質(zhì)細胞(6-7d)。在維甲酸誘導P19EC干細胞分化的早期，P19EC細胞堿性磷酸酶活性下降，失

4、去多能性特征。同時，F(xiàn)oxml及干細胞多能性維持基因Nanog、Oct4、Sox2和Utfl表達水平出現(xiàn)明顯下調(diào)，F(xiàn)oxml在RA誘導1-2天時表達量急減，且Foxml下降發(fā)生在Nanog、Oct4等基因下調(diào)之前。
　　二：P19EC干細胞中抑制Foxml表達導致多能性喪失及干細胞多能性相關(guān)基因Oct4和Nanog表達水平下降。維甲酸誘導P19EC干細胞分化早期伴隨Foxml表達下降和已知干細胞多能性相關(guān)基因如Oct4、Nanog

5、、Sox2等的表達抑制。運用能表達FoxmlsiRNA的腺病毒載體AdFoxmlshRNA感染P19EC細胞，抑制Foxml的表達，同時也導致多能性相關(guān)的堿性磷酸酶活性喪失，并造成Oct4、Nanog和Sox2表達水平下降，表明Foxml可能參與干細胞多能性的維持，并暗示Foxml可能參與Oct4、Nanog等干細胞多能性維持基因表達的調(diào)控。
　　三：P19EC干細胞中高表達Foxml阻止了干細胞分化過程中Oct4、Nanog和S

6、ox2表達下調(diào)。由于前面實驗結(jié)果暗示Foxml對干細胞多能性維持具有作用并可能參與Oct4、Nanog等干細胞多能性維持基因表達的調(diào)控，我們決定考察高表達Foxml是否能抑制分化過程中多能性基因Oct4、Nanog和Sox2的表達下調(diào)。腺病毒載體AdFoxml感染P19EC細胞后能有效高表達Foxml。先用AdFoxml感染P19EC細胞再誘導分化過程，發(fā)現(xiàn)高表達Foxml阻止了分化過程中Oct4、Nanog和Sox2的表達下降。同時還

7、發(fā)現(xiàn)在已分化4天后的P19EC細胞高表達Foxml能夠回調(diào)多能性標志基因的表達，表明Foxml能夠回調(diào)分化細胞中已下調(diào)表達的多能性相關(guān)標志基因的編程狀態(tài)。
　　四：Oct4是Foxml的靶基因。通過基因序列分析，發(fā)現(xiàn)Oct4基因的-5kb上游啟動子上含有多個Foxml的結(jié)合位點，分別在-3434bp至-3415bp、-2895bp至-2880bp、-1328bp至-1313bp存在Foxml結(jié)合位點的集中區(qū)域，暗示Foxml能夠直

8、接結(jié)合到Oct4的啟動子上。運用染色質(zhì)免疫沉淀實驗證實，內(nèi)源性Foxml只結(jié)合于Oct4啟動子的-3kb區(qū)域而不結(jié)合-1.3kb區(qū)域。將Oct4的啟動子分段克隆到Luciferase報告基因質(zhì)粒上，與Foxml的表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染實驗發(fā)現(xiàn)，Oct4啟動子的-3kb區(qū)域能有效介導Foxml的轉(zhuǎn)錄活性。
　　五：P19EC干細胞中抑制Foxml表達導致干細胞出現(xiàn)自發(fā)性肌肉及中胚層分化。為進一步確定Foxml與干細胞多能性維持有關(guān)，檢測了抑

9、制Foxml表達后的P19EC細胞的分化能力。首先發(fā)現(xiàn)干擾Foxml表達導致GATA4表達水平自發(fā)性增高。GATA4是心臟發(fā)育過程中的主要調(diào)節(jié)因子。進一步發(fā)現(xiàn)Foxml被抑制的P19EC細胞注射到裸鼠皮下所形成的畸胎癌，癌體積明顯小于對照組，并只發(fā)生中胚層方向的分化，特別是心肌細胞的分化，同時缺乏外胚層或內(nèi)胚層分化標志物的表達，表明P19EC細胞中Foxml表達水平對干細胞多能性維持具有重要影響。
　　六：在人胚胎成纖維細胞(HE

10、Fs)中高表達Foxml重新啟動Oct4、Nanog和Sox2表達。為了進一步證實Foxml能夠回調(diào)分化細胞中多能性標志基因的表達狀態(tài)，采用人胚胎成纖維細胞(hEFs)這一公認的已分化細胞，用AdFoxml對hEFs進行多次重復感染(3次/4天間隔)。在hEFs中強迫表達Foxml使成纖維細胞出現(xiàn)集落式生長，并且重新獲得堿性磷酸酶活性。高表達Foxml還導致hEFs中Oct4、Nanog和Sox2的表達升高，預示Foxml誘導hEFs重