玉米ZmA-miR528對(duì)淹水脅迫響應(yīng)的順?lè)凑{(diào)控機(jī)理研究.pdf

1、淹水脅迫或低氧脅迫直接影響玉米幼苗根系的發(fā)育，它已成為嚴(yán)重阻礙玉米生產(chǎn)的重要非生物脅迫。microRNA（miRNA）在轉(zhuǎn)錄后水平上負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)。植物miRNA在響應(yīng)各種非生物脅迫中都扮演了重要角色。本課題組前期研究表明，zma-miR528可能是參與玉米根系發(fā)育和淹水脅迫響應(yīng)調(diào)控的miRNAs之一。但zma-miR528響應(yīng)淹水脅迫的分子機(jī)理仍不清楚。
　　本研究以B73為材料，分析zma-miR528對(duì)不同激素和非生物脅

2、迫的響應(yīng)。進(jìn)一步地，我們對(duì)不同玉米自交系中zma-miR528啟動(dòng)子區(qū)的變異及其與淹水脅迫響應(yīng)的關(guān)系進(jìn)行了研究，鑒定調(diào)控zma-miR528對(duì)淹水脅迫響應(yīng)的順式作用元件;利用酵母單雜交技術(shù)，篩選作用于特異性順式作用元件的反式作用因子，以期闡明調(diào)控zma-miR528響應(yīng)淹水脅迫的分子機(jī)理。主要研究成果如下:
　　1.利用Stem-loop RT-qPCR，分析不同條件下B73zma-miR528的表達(dá)，結(jié)果表明，B73幼苗根系z(mì)m

3、a-miR528受ABA、NAA、GA3、KT、Ethylene、NaCl、10℃低溫多種激素和非生物脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。
　　2.采用PCR技術(shù)，在140份玉米自交系中，分別獲得130個(gè)zma-miR528a的啟動(dòng)子序列和122個(gè)zma-miR528b的啟動(dòng)子序列。以B73的zma-miR528啟動(dòng)子為參考序列，比較分析表明，zma-miR528a/b啟動(dòng)子序列具有遺傳多樣性，主要表現(xiàn)在zma-miR528a啟動(dòng)子序列-1429 bp

4、至-1647 bp存在218 bp的缺失，zma-miR528b啟動(dòng)子序列在-637/-636 bp存在1077 bp的插入、在-363/-362 bp存在248 bp的插入。根據(jù)啟動(dòng)子序列的比對(duì)結(jié)果，將啟動(dòng)子序列大體分為2類序列變異:一類是，類似于B73和Mo17的zma-miR528啟動(dòng)子序列;另一類是，類似于Hz32的zma-miR528啟動(dòng)子序列。
　　3.在130份自交系中，共檢測(cè)到zma-miR528a啟動(dòng)子序列有10

5、0個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，包括22個(gè)InDels，78個(gè)SNPs。在122份自交系中，共檢測(cè)到zma-miR528b啟動(dòng)子序列有60個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，包括12個(gè)InDels，48個(gè)SNPs。關(guān)聯(lián)分析表明，與zma-miR528淹水脅迫下的表達(dá)顯著關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)有8個(gè)，其中6個(gè)位點(diǎn)位于zma-miR528a啟動(dòng)子區(qū)，2個(gè)位點(diǎn)位于zma-miR528b啟動(dòng)子區(qū)。各啟動(dòng)子內(nèi)的位點(diǎn)高度連鎖不平衡。8個(gè)位點(diǎn)主要形成4種單倍型，其中，zma-miR528a啟動(dòng)子的6

6、個(gè)位點(diǎn)的等位基因型主要形成haplotype1和haplotype2兩種單倍型，zma-miR528b啟動(dòng)子的2個(gè)位點(diǎn)的等位基因型主要形成haplotype3和haplotype4兩種單倍型。zma-miR528淹水脅迫下的表達(dá)變化，在單倍型haplotype1和haplotype2的玉米自交系中具有極顯著的差異，在單倍型haplotype3和haplotype4的玉米自交系中也具有極顯著的差異。我們將檢測(cè)到的8個(gè)位點(diǎn)作為調(diào)控zma-m

7、iR528淹水脅迫下表達(dá)的候選功能位點(diǎn)。
　　4.在haplotype1序列中，預(yù)測(cè)到順式作用元件RHERPATEXPA7，并存在與轉(zhuǎn)錄因子OBP和OBF結(jié)合的順式作用元件具有同源性的2個(gè)motif,且轉(zhuǎn)錄因子OBP是轉(zhuǎn)錄因子OBF的結(jié)合蛋白;在haplotype2序列中，預(yù)測(cè)到順式作用元件LTRECOREATCOR15，并存在與順式作用元件ABRELATERD1具有同源性的3個(gè)motif。在haplotype3和haplotyp

8、e4序列中沒(méi)有預(yù)測(cè)到順式作用元件。
　　5.已完成酵母單雜交文庫(kù)的構(gòu)建，并以B73zma-miR528a啟動(dòng)子構(gòu)建了含有haplotype1序列的pBait-AbAi載體:p528a1-AbAi，以B73zma-miR528a啟動(dòng)子-545 bp至-10 bp為bait序列;以Hz32zma-miR528a啟動(dòng)子構(gòu)建了含有haplotype2序列的pBait-AbAi載體:p528a2-AbAi，以Hz32zma-miR528a啟