玉米根系低磷脅迫響應分子機理的初步研究.pdf

1、土壤中有效磷的缺乏是一個全球性的問題，是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和作物產(chǎn)量提高的重要限制性因子。培育作物磷高效吸收利用型品種是解決由土壤有效磷缺乏而帶來的一系列問題的重要途徑之一。在我國和世界其他國家的主要玉米產(chǎn)區(qū)，土壤有效磷缺乏已成為一個不爭的事實，嚴重制約了玉米產(chǎn)量的增加。培育和推廣玉米磷高效吸收利用型品種是今后這些地區(qū)玉米生產(chǎn)實現(xiàn)低投入穩(wěn)產(chǎn)出、農(nóng)業(yè)生態(tài)和諧發(fā)展的有效保證。因此，鑒定和篩選玉米耐低磷種質(zhì)資源、尋找低磷脅迫響應的重要性狀及關(guān)鍵基因

2、、探明玉米耐低磷的分子調(diào)控機制，并借助傳統(tǒng)育種方法和現(xiàn)代分子生物學技術(shù)是尋找和培育高效、穩(wěn)定和安全的磷高效玉米品種的有效途徑。本研究在前期耐低磷材料篩選鑒定的基礎(chǔ)上，對不同磷營養(yǎng)條件下玉米自交系在低磷脅迫下根系性狀的變化情況進行了考察，同時利用基因芯片技術(shù)和miRNA克隆的方法，對磷高效吸收利用型玉米自交系178的根系在低磷脅迫下差異基因和相關(guān)miRNA進行了鑒定與分析，并結(jié)合酶活性、半定量RT-PCR和實時熒光定量PCR(Real-t

3、imePCR)等方法對部分候選基因和miRNA進行了分析，得到的主要結(jié)果如下：
　　 1.采用大田和沙土培養(yǎng)的方式，對前期大田低磷脅迫篩選得到的20份表現(xiàn)差異的玉米自交系進行了重復性的鑒定，結(jié)果與課題組前期鑒定結(jié)果基本一致。鑒定篩選得到了磷高效吸收利用玉米自交系3份，分別是178、RP125和99S2052-2；磷低效自交系10份。
　　 2.采用沙土培養(yǎng)和營養(yǎng)液培養(yǎng)的方式，對鑒定出的3份磷高效吸收利用玉米自交系和3份磷

4、低效自交系在低磷脅迫下的根系性狀進行了分析，研究發(fā)現(xiàn)3份磷高效吸收利用型自交系在根系總長度、根總條數(shù)和根表面積的絕對值以及增長率上均優(yōu)于3份磷低效自交系。
　　 3.利用Affymetrix玉米基因組表達譜芯片雜交技術(shù)，篩選得到487個在178低磷脅迫處理3d后根系中差異表達的基因，其中上調(diào)表達的基因有349個，下調(diào)表達的基因有138個。對這些差異表達基因的功能進行分類注釋后發(fā)現(xiàn)，這些基因涉及物質(zhì)與能量代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、物質(zhì)的吸收

5、與轉(zhuǎn)運、脅迫響應、激素信號轉(zhuǎn)導和電子傳遞等過程。
　　 4.采用Real-timePCR方法對玉米無機磷轉(zhuǎn)運因子、酸性磷酸酶、植酸酶、2-脫氧麥根酸合成酶、過氧化物酶、MYB轉(zhuǎn)錄因子等7個重要候選基因在低磷脅迫下178根系中的差異表達情況進行了分析，結(jié)果表明7個候選基因的總體表達趨勢與基因芯片所揭示的表達趨勢基本吻合，不同基因間在低磷脅迫后不同時間段的表達趨勢存在差異。
　　 5.對同期處理的玉米自交系178根系中磷含量

6、，酸性磷酸酶（胞內(nèi)/胞外）、植酸酶、過氧化物酶及根系活力等特征進行了檢測，結(jié)果表明低磷脅迫下根系中含磷量呈現(xiàn)出了明顯的下降趨勢，胞內(nèi)酸性磷酸酶活性受低磷脅迫誘導，其增長趨勢較為明顯，而胞外酸性磷酸酶變化并不十分明顯，POD活性明顯增加，植酸酶活性上升平穩(wěn)，根系活力呈下降趨勢。
　　 6.成功構(gòu)建了低磷脅迫下磷高效吸收利用型玉米自交系178根系的小分子RNA文庫，菌液PCR檢測后共獲得263個克隆，經(jīng)測序及序列生物信息學分析后共得

7、到12條符合標準的候選miRNA序列，進一步比對分析后發(fā)現(xiàn)12條候選miRNA中有2個已知miRNA(miRNA156和miRNA399)和10個新的miRNA。
　　 7.利用生物信息學分析方法對候選miRNA進行物種間保守性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除2個已知miRNA在植物物種中具有較高的保守性外，新發(fā)現(xiàn)了1個miRNA（Zm-miRNA2）在禾本科植物上具有一定的保守性。同時，序列比對還發(fā)現(xiàn)Zm-miRNA9為玉米miRNA169家

8、族新的成員。
　　 8.采用RT-PCR方法對12個候選miRNA的真實性和表達特征進行了分析，結(jié)果表明除Zm-miRNA6只能在低磷脅迫處理后12h、24h和48h被檢測到外，其余miRNA均能在大部分處理時間段(0h、12h、24h、48h、72h、96h)中被檢測到。Zm-miRNA2、Zm-miRNA3、Zm-miRNA5、Zm-miRNA6、Zm-miRNA9和miRNA399b可能存在誘導表達；Zm-miRNA1和Z

9、m-miRNA7可能存在著下調(diào)表達；另外Zm-miRNA8和Zm-miRNA10可能存在先上調(diào)后下調(diào)的表達趨勢，而miRNA156的表達則無明顯差異。
　　 9.利用生物信息學在線miRNA靶基因預測軟件，對12個候選miRNA進行了靶基因預測，結(jié)果表明，除Zm-miRNA9未找到靶基因外，其余11個miRNA共預測得到57個靶基因，涉及物質(zhì)與能量代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、物質(zhì)轉(zhuǎn)運、脅迫響應和信號轉(zhuǎn)導等過程。進一步分析發(fā)現(xiàn)預測獲得的靶基因

10、與基因芯片篩選得到的差異表達基因部分相同，如miRNA399b和Zm-miRNA3靶向的無機磷轉(zhuǎn)運子(TC420181)，Zm-miRNA2靶向的bZIP轉(zhuǎn)錄因子(EE023309)，Zm-miRNA5靶向的Ubiquitincarrierprotein(TC432098)、Zm-miRNA6靶向的GST(TC385801)等。
　　 10.采用Real-timePCR對miRNA399b和Zm-miRNA3及其可能的靶基因Zm

11、PT1/2的表達特征進行了分析，結(jié)果表明miRNA399b在玉米根系響應低磷脅迫的過程具有明顯的被誘導表達趨勢，Zm-miRNA3的表達表現(xiàn)出先誘導后抑制的趨勢，整體表現(xiàn)出誘導表達的趨勢。
　　 11.結(jié)合基因芯片和miRNA靶基因預測的結(jié)果，參考水稻和擬南芥在低磷脅迫下可能存在的調(diào)控機制和信號通路，闡述了玉米在低磷脅迫下，其根系產(chǎn)生的可能適應性機制，并模擬了幾種代謝途徑和信號通路及miRNA介導的表達調(diào)控途徑在玉米耐低磷脅迫中