異體反應(yīng)性NK細(xì)胞在小鼠單倍體骨髓移植治療肺癌中的作用初探.pdf

1、第一部分:NK細(xì)胞在小鼠非清髓單倍體骨髓移植中的作用 目的：探討異體反應(yīng)性NK細(xì)胞在小鼠非清髓單倍體骨髓移植中的作用。 方法：以近交系C57BL/6J（H-2Dd）雌鼠為受鼠，以C57BL/6J×BALB/c雜交F1代（H-2Db/d）雌鼠為供鼠，以氟達(dá)拉賓與環(huán)磷酰胺為移植前的非清髓化療方案，進(jìn)行H-2單倍體骨髓移植。應(yīng)用高強(qiáng)度磁珠分選系統(tǒng)純化NK細(xì)胞亞群。分選前后NK細(xì)胞的純度用流式細(xì)胞儀檢測(cè)；采用LDH釋放法檢測(cè)磁珠

2、分選后的NK細(xì)胞對(duì)Yac-1淋巴瘤細(xì)胞、自體及異體淋巴細(xì)胞的殺傷。按照對(duì)C57小鼠預(yù)處理?xiàng)l件的不同分為四組：A組、B組、C組和D組。A組用化療方案作為預(yù)處理，不行骨髓移植；B組以化療方案與供體的NK細(xì)胞的輸注作為預(yù)處理，不行骨髓移植；C組先行化療預(yù)處理，再行骨髓移植；D組預(yù)處理?xiàng)l件為化療與供體NK的輸注，輸注NK細(xì)胞的同時(shí)行骨髓移植。A組與B組小鼠，計(jì)數(shù)小鼠脾臟與骨髓單個(gè)核細(xì)胞數(shù)，觀察NK細(xì)胞對(duì)清髓的作用。移植后，觀察C組與D組小鼠GV

3、HD的發(fā)生情況，包括體重、飲食、活動(dòng)、豎毛情況及肝臟、腎臟、腸道的病理情況；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)C、D兩組小鼠H-2Dd細(xì)胞比例，檢測(cè)供體嵌合情況；以F1代小鼠淋巴細(xì)胞作為刺激細(xì)胞，以移植后小鼠的淋巴細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，行單向混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)。 結(jié)果：分選前脾臟單個(gè)核細(xì)胞中NK細(xì)胞的比例為（19.85±4.27）%，分選后NK細(xì)胞的比例為（74.63±5.5）%；NK細(xì)胞亞型對(duì)Yac-1細(xì)胞的殺傷活性為（65.52±8.76）%； F

4、1代小鼠純化NK細(xì)胞亞型對(duì)異體C57小鼠淋巴細(xì)胞的殺傷活性為（60.18±1.03）%；而受體的NK細(xì)胞對(duì)自體的淋巴細(xì)胞無(wú)殺傷活性。B組小鼠骨髓的清髓效果要比A組好，而對(duì)脾臟的單個(gè)核細(xì)胞的清除，兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。D組與C組比較，H-2Dd細(xì)胞比例明顯增高，移植后28天C組小鼠脾臟嵌合率為（7.50±0.70）%，骨髓中供體細(xì)胞嵌合率為（10.2±2.40）%，D組小鼠脾臟嵌合率為（46.20±5.00）%，骨髓嵌合率為（28.7±5.9

5、）%；C組與D組小鼠體重比較，P=0.117，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，C組小鼠肝臟及腸道可見GVHD表現(xiàn)，而D組小鼠無(wú)明顯的GVHD?；旌狭馨图?xì)胞培養(yǎng)結(jié)果顯示，與正常C57小鼠相比，C組與D組小鼠的淋巴細(xì)胞增殖比例降低，而D組小鼠增殖比例的降低程度比C組要高。 結(jié)論：異體反應(yīng)性NK細(xì)胞可清除供體的造血細(xì)胞，在單倍體非清髓骨髓移植中促進(jìn)移植物的植入，而無(wú)明顯的GVHD表現(xiàn)，并誘導(dǎo)供體淋巴細(xì)胞在受體內(nèi)的免疫耐受。 第二部分:DLI在單

6、倍體骨髓移植后小鼠的抗瘤作用及其體內(nèi)分布 目的：建立移植后腫瘤復(fù)發(fā)模型，觀察DLI的抗腫瘤作用及體內(nèi)分布情況。 方法：骨髓移植的方法及NK細(xì)胞的分選同第一部分。在體外，用LDH釋放法檢測(cè)NK細(xì)胞對(duì)LLC的殺傷活性。首先，建立移植后腫瘤復(fù)發(fā)模型，骨髓移植后14天，所有小鼠皮下種植LLC肺癌細(xì)胞，每只小鼠種植1×106個(gè)細(xì)胞，種瘤后10天成瘤，此為DLI治療時(shí)間點(diǎn)；DLI治療的淋巴細(xì)胞來(lái)源于供體F1代小鼠的脾臟，每只小鼠2×

7、107個(gè)細(xì)胞.第二步，檢測(cè)DLI后供體淋巴細(xì)胞的體內(nèi)分布，按預(yù)處理?xiàng)l件的不同分為兩組，化療組與化療加NK組，移植后18天，F(xiàn)1代小鼠脾臟細(xì)胞經(jīng)同位素32P-ATP標(biāo)記，作為供體淋巴細(xì)胞輸入，于注射后不同時(shí)間點(diǎn)取外周血、肺、肝、脾，腎、腸及骨髓，測(cè)量放射性活性；最后觀察DLI的抗腫瘤作用，C57小鼠分為5組，A組、B組、C組、D組與E組。A組為化療組，預(yù)處理為化療方案，不行DLI治療腫瘤；B組為化療加NK組，預(yù)處理為化療與供體的NK細(xì)胞，

8、不行DLI；C組為化療加治療組、預(yù)處理?xiàng)l件為化療，行DLI治療腫瘤；D組為化療加NK加治療組，預(yù)處理同B組，行DLI治療；E組為對(duì)照組，不行骨髓移植與DLI.移植后14天種瘤，移植后24及28天行DLI治療，每天測(cè)量腫瘤大小。 結(jié)果：在體外供體NK細(xì)胞對(duì)LLC腫瘤細(xì)胞的殺傷活性為（65.52±8.76）%。異基因骨髓移植后行DLI后，在肺、脾臟、腎臟、肝臟等部位的所檢測(cè)到的放射性活性，化療組加NK組明顯要比化療組高。DLI治療前