綿羊種布魯氏菌致病的分子機制研究.pdf

1、目的：布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種人、畜共患傳染病。人感染后表現(xiàn)為“波浪熱”,家畜感染后易造成流產。病原學研究發(fā)現(xiàn),布魯氏菌外膜蛋白和Ⅳ型分泌系統(tǒng)家族蛋白與布魯氏菌的侵染、胞內生存、繁殖有直接關系,是公認的毒力因子。探討布魯氏菌的胞內寄生機制的分子基礎與布魯氏菌毒力因子和巨噬細胞靶蛋白結合密不可分,進而為繪制布魯氏菌表面蛋白與巨噬細胞相互作用的蛋白質網絡提供技術方案,為選擇布魯氏菌病藥物作用的侯選靶點奠定理論依據,為抗布魯氏菌病的綿

2、羊抗病育種工作提供可供篩選、比較的侯選基因。 方法：(1)利用高變8聚核苷酸DNA指紋技術(HOOF-Prints)對綿羊種布魯氏菌019株可變數目重復片段(V-NTR)的8個位點進行PCR擴增和序列測定,將測定結果與GenBank數據庫比較分析,構建系統(tǒng)進化樹,確立綿羊種布魯氏菌019株在布魯氏菌分類學中的地位；(2)用分子克隆技術對綿羊種布魯氏菌019株的目標基因(外膜蛋白基因omp31和IV型分泌系統(tǒng)蛋白基因virB2、v

3、irB3、virB5、virB8基因)進行克隆、測序,并將目標基因構建到酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7中：(3)建立綿羊種布魯氏菌019株侵染綿羊肺泡巨噬細胞的感染模型,利用酵母雙雜交捕獲載體系統(tǒng)構建綿羊巨噬細胞cDNA文庫；(4)利用構建的酵母雙雜交誘餌系統(tǒng)和捕獲系統(tǒng)進行巨噬細胞捕獲蛋白的篩選,并對部分捕獲蛋白應用免疫共沉淀驗證,確立互作的靶蛋白。 結果：(1)綿羊種布魯氏菌019株八個位點的重復序列與參考株對應序列相比,一致

4、性較差,只有Locus1,Locus6和Locus8與綿羊種布魯氏菌標準株63/290的對應位點重復序列一致,而019株的8個位點重復序列與B.abortus 2308、B.suis 1330的對應位點沒有共同的重復序列次數,遺傳進化樹分析,綿羊種布魯氏菌019株與標準株63/290的親緣關系最高；(2)測序表明綿羊種布魯氏菌019株omp31、virB2、virB3、virB5和virB8基因與參考株對應基因相比,兩者omp31基因的

5、同源性為98％,兩者virB5、virB8基因的同源性為99％,兩者virB2、virB3基因的同源性為100％,攜帶有目標基因的誘餌系統(tǒng)無自激活活性：(3)構建的綿羊種布魯氏菌019株侵染綿羊巨噬細胞cDNA文庫的庫容量為1.364×105,重組率為95.65％；(4)酵母雙雜交結果顯示:pGBKT7-omp31誘餌質粒最終獲得2個陽性AD質粒,這些質粒的插入片段與牛的特異性半乳糖苷凝集素、趨化因子配體16高度同源:pGBKT7-vi

6、rB2誘餌質粒最終獲得3個陽性AD質粒,這些質粒的插入片段與牛的CD48分子、趨化因子配體、溶酶體輔助蛋白2高度同源:pGBKT7-virB3誘餌質粒最終獲得2個陽性AD質粒,這些質粒的插入片段與牛的溶酶體輔助蛋白2、未知蛋白高度同源；pGBKT7-virB5誘餌質粒最終獲得3個陽性AD質粒,這些質粒的插入片段與牛的嘌呤核苷酸磷酸酶、含鐵素重鏈多肽、26S蛋白酶體非ATP酶調節(jié)亞基8高度同源；pGBKT7-virB8誘餌質粒最終獲得9個

7、不同的陽性AD質粒,這些質粒的插入片段與牛的IGS15泛素樣修飾子、腫瘤壞死因子誘導蛋白、脂肪酸結合蛋白4、C19orf10樣蛋白、趨化因子配體16、N-myc作用子、類固醇樣急性凋節(jié)蛋白、2種未知蛋白高度同源；免疫共沉淀結果顯示：外膜蛋白OMP31與綿羊巨噬細胞特異性半乳糖苷凝集素和類趨化因子(C-X-Cmotif)配體16發(fā)生相互作用；Ⅳ型分泌系統(tǒng)家族蛋白VirB5與綿羊巨噬細胞含鐵素重鏈多肽發(fā)生相互作用。 結論：(1)綿羊