白假絲酵母菌生物膜中滯留菌形成的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及其相關(guān)基因的初步篩選.pdf

1、目的：
　　 白假絲酵母菌（白色念珠菌）是人類常見的條件致病真菌，生物膜是包括其在內(nèi)的幾乎所有微生物在自然界中的生存方式，生物膜微生物具有超強(qiáng)耐藥性。其可能機(jī)制包括:生物膜中胞外基質(zhì)抗藥物滲透的物理屏障作用、生物膜中菌株生長(zhǎng)遲緩導(dǎo)致對(duì)藥物的敏感性降低、基因突變耐藥株的產(chǎn)生等，但這些不能完全解釋生物膜耐藥性。
　　 2001年，Lewis等發(fā)現(xiàn)，銅綠假單胞菌生物膜中其實(shí)只有極少數(shù)菌株能夠耐受較高濃度的藥物作用且具有多藥耐受

2、性，因其耐藥特征不具有遺傳性，被稱為“滯留菌或持留菌(Persisters)”。Lewis認(rèn)為，這些菌株可能是生物膜耐藥性的真正原因，并且與臨床上常見的慢性反復(fù)性感染密切關(guān)聯(lián)，但其形成機(jī)制尚不清楚。2006年，Lafleur等發(fā)現(xiàn)白假絲酵母菌中也存在“滯留菌”，但與細(xì)菌滯留菌不同的是，白假絲酵母菌滯留菌只存在于生物膜狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行白假絲酵母菌生物膜中滯留菌形成的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，分析白假絲酵母菌生物膜中滯留菌產(chǎn)生的形成特點(diǎn)，確定滯留菌產(chǎn)生

3、比例變化較大的兩狀態(tài);進(jìn)一步運(yùn)用SSH（抑制性消減雜交）方法篩選兩狀態(tài)之間差異表達(dá)基因，即可能與滯留菌產(chǎn)生有關(guān)的基因，為下一步尋找滯留菌產(chǎn)生相關(guān)基因、揭開其產(chǎn)生機(jī)制及相關(guān)途徑奠定基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：
　　 (1)白假絲酵母菌生物膜中滯留菌形成的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及分析
　　 分別以兩相型白假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌液構(gòu)建體外生物膜模型，CFU計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間段生物膜加藥前真菌細(xì)胞繁殖數(shù)目及加藥后滯留菌產(chǎn)生數(shù)目，確定滯留菌產(chǎn)生

4、數(shù)目變化較大的兩狀態(tài);結(jié)合激光共聚焦顯微鏡(CLSM)，觀察生物膜形態(tài)變化，分析滯留菌產(chǎn)生的影響因素。
　　 (2)SSH方法構(gòu)建白假絲酵母菌兩狀態(tài)之間cDNA消減文庫，初步篩選滯留菌產(chǎn)生相關(guān)基因
　　 運(yùn)用SSH（抑制性消減雜交）技術(shù)，針對(duì)上一步得出的白假絲酵母菌兩狀態(tài)之間進(jìn)行雙向雜交，分別篩選出兩狀態(tài)之間差異表達(dá)的基因，經(jīng)克隆擴(kuò)增、PCR方法鑒定重組質(zhì)粒，隨機(jī)挑選陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，并在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性

5、比較。
　　 結(jié)果：
　　 (1)兩相型菌液形成的不同時(shí)間段生物膜，真菌細(xì)胞繁殖數(shù)目及滯留菌數(shù)目均無顯著差異。其中，真菌細(xì)胞繁殖數(shù)目呈“S”形生長(zhǎng)，12h后漸穩(wěn)定;滯留菌0.5h即大量產(chǎn)生，2h后數(shù)目已基本穩(wěn)定，此時(shí)鏡下生物膜處于微菌落始形成期。
　　 (2)消減文庫構(gòu)建成功。經(jīng)鑒定，文庫獲得EST片段平均插入片段在300bp-600bp左右，重組率大于95％，正反向消減文庫的容量分別為2800和2600個(gè);其中

6、，正反向文庫分別挑選200個(gè)陽性克隆子測(cè)序，共獲得388條有效EST,聚類拼接后得到238條單基因簇(unigenes)，包括53個(gè)重疊群(contigs)和185個(gè)單拷貝(singlets)。
　　 結(jié)論：
　　 (1)白假絲酵母菌滯留菌的形成與其生物膜形成初期（2h內(nèi)）附著表面的誘導(dǎo)密切相關(guān)，而與其生物膜成熟程度及兩相型狀態(tài)無顯著關(guān)聯(lián)。
　　 (2)SSH方法是快速篩選差異表達(dá)基因的有效方法，我們獲得的cDN