CCR3拮抗劑在實(shí)驗(yàn)性角膜新生血管發(fā)生過(guò)程中的作用和機(jī)制.pdf

1、背景與目的：
　　正常角膜的透明性是維持良好視力的重要因素之一。當(dāng)炎癥、外傷、缺氧等因素破壞了促血管生成因子和抑制血管生成因子之間的平衡，促使血管從角膜緣長(zhǎng)入角膜，是導(dǎo)致視力減退甚至盲目的一個(gè)主要原因。目前關(guān)于角膜新生血管(CRNV)的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子等炎癥介質(zhì)發(fā)揮的作用一直是研究關(guān)注的重點(diǎn)。
　　CC趨化因子受體3（CCR3）是一個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體，主要表達(dá)在嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、Th

2、2淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞及巨噬細(xì)胞，其中嗜酸性粒細(xì)胞高表達(dá)。既往研究CCR3的主要功能是募集白細(xì)胞（主要是嗜酸性粒細(xì)胞和Th2細(xì)胞）至炎癥部位，參與過(guò)敏性疾病（如哮喘）的發(fā)病機(jī)制。此外，CCR3也表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并參與血管生成。而且CCR3信號(hào)在脈絡(luò)膜新生血管的發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。并參與角膜縫線(xiàn)法誘導(dǎo)小鼠角膜新生血管的生長(zhǎng)，但CCR3信號(hào)在角膜新生血管中的表達(dá)及具體作用機(jī)制仍不明確。
　　堿燒傷誘導(dǎo)的 CRNV是一種被普遍認(rèn)可的

3、角膜新生血管的動(dòng)物模型。為了明確CCR3信號(hào)在角膜新生血管中的表達(dá)及作用機(jī)制，本課題從建立小鼠堿燒傷CRNV模型著手，應(yīng)用Real-time PCR方法檢測(cè)CCR3、Eotaxin mRNA在受損角膜組織中各個(gè)時(shí)間點(diǎn)上的表達(dá)。應(yīng)用角膜鋪片熒光染色法和流式細(xì)胞術(shù)觀察局部應(yīng)用CCR3小分子拮抗劑SB328437進(jìn)行早期干預(yù)后，對(duì)堿燒傷誘導(dǎo)的CRNV形成的影響。采用Real-time PCR和Western blot法從基因水平及蛋白水平檢測(cè)

4、并比較SB328437早期干預(yù)后角膜組織內(nèi)VEGF表達(dá)的變化，明確CCR3信號(hào)的作用機(jī)制。并應(yīng)用培養(yǎng)的人視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞株（HREC），通過(guò)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和管腔形成實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證實(shí)CCR3信號(hào)在血管發(fā)生、發(fā)展中的作用，為臨床治療新生血管性眼病提供了一定的理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1. BALB/c小鼠60只，以堿燒傷誘導(dǎo)CRNV模型，收集堿燒傷后0 d、2 d、4 d、7 d各時(shí)間點(diǎn)的角膜組織，以Real-time P

5、CR檢測(cè)堿燒傷誘導(dǎo)小鼠CRNV過(guò)程中角膜組織內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)CCR3、Eotaxin mRNA的表達(dá)。
　　2. BALB/c小鼠60只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。堿燒傷后立即予局部點(diǎn)眼干預(yù)：實(shí)驗(yàn)組使用1μmol/ml CCR3拮抗劑，對(duì)照組使用0.2%透明質(zhì)酸鈉，每天3次，每次3μl，共干預(yù)1周。在角膜組織堿燒傷2周后，大體拍照初步觀察兩組角膜新生血管形成情況后處死小鼠并摘除實(shí)驗(yàn)眼球，應(yīng)用角膜鋪片CD31熒光染色法檢測(cè)新生血管區(qū)域占整個(gè)

6、角膜的面積比例，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)角膜組織中CD31陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，觀察CCR3拮抗劑對(duì)堿燒傷CRNV形成的影響。
　　3. BALB/c小鼠60只，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組：干預(yù)方法同前，堿燒傷后4 d，收集各組角膜組織，應(yīng)用Real-time PCR及Western blot法從基因水平和蛋白水平檢測(cè)各組角膜組織中VEGF的表達(dá)。觀測(cè)CCR3信號(hào)通路與角膜組織內(nèi)VEGF表達(dá)的相關(guān)性。
　　4. HREC細(xì)胞鋪于96孔培養(yǎng)板中

7、。隨機(jī)分為五組，分別以0.1μmol/ml，0.2μmol/ml，0.5μmol/ml，1μmol/ml的CCR3-antagonist干預(yù)，等量的PBS緩沖液作為對(duì)照。干預(yù)24 h后加入CCK8細(xì)胞增殖檢測(cè)液，分光光度儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔OD值。通過(guò)OD值計(jì)算和分析CCR3-antagonist對(duì)HREC細(xì)胞株增殖的影響。
　　5. HREC細(xì)胞鋪于含Matrigel的96孔培養(yǎng)板中，隨機(jī)分為1μmol/ml CCR3-

8、antagonist干預(yù)組和PBS緩沖液對(duì)照組。在37℃，50 ml/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，觀察管腔形成情況。測(cè)定CCR3拮抗劑對(duì)HREC血管網(wǎng)形成的影響。
　　結(jié)果：
　　1.堿燒傷后CCR3、Eotaxin mRNA的表達(dá)有升高趨勢(shì)，提示CCR3-Eotaxin信號(hào)參與堿燒傷誘導(dǎo)的角膜新生血管的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。
　　2.局部應(yīng)用CCR3-antagonist能抑制堿燒傷誘導(dǎo)的CRNV。
　　3. C