砂梨果實(shí)乙烯受體基因的克隆、表達(dá)調(diào)控及其RNAi載體的構(gòu)建.pdf

1、砂梨(Pyrus pyrifolia Nakai)原產(chǎn)于我國(guó)中部、南部和西部各省，適于在溫暖多雨地區(qū)栽培，是原產(chǎn)于我國(guó)的四個(gè)梨樹種之一，具有耐熱、抗旱、抗火疫病等優(yōu)良性狀。但其果實(shí)大多貯藏性差，如何提高果實(shí)耐貯性是解決砂梨產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問題。冷藏和氣調(diào)貯藏是目前延長(zhǎng)砂梨貯藏期的的主要技術(shù)手段，但這些技術(shù)在大多數(shù)砂梨品種上難以保證果實(shí)的長(zhǎng)期貯藏，滿足不了市場(chǎng)的需求.培育耐貯藏的優(yōu)質(zhì)新品種，結(jié)合保鮮劑等采后技術(shù)手段是解決砂梨貯藏問題的關(guān)鍵.我

2、們以‘菊水’梨果實(shí)為材料，利用RT-PCR和RACE技術(shù)克隆到PpETR3和PpERS2兩個(gè)乙烯受體基因cDNA全長(zhǎng)，構(gòu)建它們的RNAi表達(dá)載體，并將PpETR3表達(dá)載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行番茄轉(zhuǎn)化，獲得了2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，為進(jìn)一步驗(yàn)證PpETR3乙烯受體在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的功能及培育耐貯藏的番茄新品種奠定基礎(chǔ)。同時(shí)研究外源乙烯和乙烯受體抑制劑1-MCP(1-甲基環(huán)丙稀)熏蒸對(duì)采后不同時(shí)期‘菊水’(‘kikusui’)果實(shí)的生理以及Pp

3、ETR3和PpERS2基因表達(dá)的影響.結(jié)合果實(shí)采后生理的變化，揭示PpETR3和PpERS2兩個(gè)受體在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的功能。 1、為獲得符合果實(shí)基因克隆和表達(dá)研究需要的RNA，我們以‘菊水’梨果實(shí)為材料，通過兩種CTAB改良法提取不同后熟期的果皮和果肉的總RNA，研究果實(shí)不同后熟期對(duì)果皮和果肉總RNA提取的質(zhì)量和產(chǎn)量的影響，并針對(duì)不同梨果實(shí)成熟階段RNA提取的特點(diǎn)，對(duì)傳統(tǒng)的CTAB法進(jìn)行改良，以較低的成本從果實(shí)中提取完整性好

4、、質(zhì)量高的總RNA.同時(shí)在近成熟的‘紅富士’葡萄、‘富士’蘋果和‘豐香’草莓等3種果實(shí)上進(jìn)一步驗(yàn)證，并通過RT-PCR驗(yàn)證，所提取的總RNA可以滿足基因克隆和表達(dá)等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的要求。 2、根據(jù)已報(bào)道其它植物果實(shí)乙烯受體基因的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，用RT-PCR和RACE的方法從‘菊水’梨果實(shí)中獲得兩個(gè)新的砂梨乙烯受體基因PpETR3和PpERS2的cDNA全長(zhǎng)，分別為2707bp和2260bp，各有2223bp和1914bp

5、完整的開放閱讀框(ORF)，GenBank登錄號(hào)分別為EU021507和EU117197。PpETR3編碼741個(gè)氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列與蘋果、梨、李和桃等4中果實(shí)乙烯受體家族中ETR1亞類基因相似性和同源性在90-98％。分子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：受體蛋白理論分子量為83.01kD，理論等電點(diǎn)為8.26.PpERS2編碼638個(gè)氨基酸，其核苷酸和氨基酸序列與蘋果、梨等果實(shí)乙烯受體家族ETR2亞類相似性和同源性為90-96％。分子結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：受

6、體蛋白理論分子量為71.55kD，理論等電點(diǎn)為6.25。 3、用80μL-L-1外源乙烯和1.0μL-L-11-MCP熏蒸采后不同時(shí)期‘菊水’梨果實(shí)，在25±1℃貯藏溫度下，研究處理后果實(shí)后熟過程中品質(zhì)、生理指標(biāo)的變化和乙烯受體基因PpETR3和PpERS2表達(dá)。結(jié)果顯示：在采收當(dāng)天和呼吸躍變初期，外源乙烯處理能促進(jìn)果實(shí)硬度和可溶性固形物含量的顯著地下降，降低活性氧清除酶(SOD、CAT和APX)的活性，提高呼吸速率和乙烯釋放速

7、率，促進(jìn)果實(shí)后熟；1-MCP處理表現(xiàn)出與乙烯相反的效應(yīng)，且采收當(dāng)天比呼吸躍變初期的作用效果更明顯。在呼吸躍變中期處理，外源乙烯和1-MCP作用效果均不明顯。研究發(fā)現(xiàn)，外源乙烯和1-MCP對(duì)果實(shí)后熟的影響因處理果實(shí)后熟期的不同而存在顯著差異，果實(shí)后熟程度越高，其處理的效果越不明顯.在采收當(dāng)天處理的果實(shí)后熟過程中，對(duì)照果實(shí)PpETR3和PpERS2表達(dá)總體上隨著果實(shí)的后熟逐漸增強(qiáng)。1-MCP處理明顯提高果實(shí)采后初期PpETR3基因的表達(dá)，降

8、低果實(shí)采后中期PpERS2基因的表達(dá)，然而外源乙烯對(duì)果實(shí)采后初期PpERS2表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用，對(duì)果實(shí)整個(gè)后熟期間PpETR3表達(dá)沒有明顯地影響。 4、以‘菊水’梨近成熟果實(shí)為材料，提取總RNA。通過RT-PCR技術(shù)克隆砂梨乙烯受體基因PpETR3和PpERS2反義、正義基因片段，然后將反義、間隔區(qū)YYT-1(GenBank登錄號(hào)AY345165)和正義三基因片段串連，構(gòu)建雙鏈RNAi重組質(zhì)粒，經(jīng)鑒定測(cè)序正確后，作為外源基因單

9、元插入酶切后的植物雙元表達(dá)載體pYF7704質(zhì)粒中，分別構(gòu)建這2個(gè)乙烯受體基因雙鏈RNAi表達(dá)載體pYF0810和pYF0811，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞中。 5、為了研究乙烯受體PpETR3干擾基因在植物體中的表達(dá)特性，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化番茄子葉，將侵染的493個(gè)外植體先經(jīng)MS+ZT1mg/L+IAA0.5mg/L+Km50mg/L+250mg/L Cef+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L(pH5.8)篩選培養(yǎng)基，