持續(xù)快速起搏左心耳致犬慢性房顫心房電重塑、結(jié)構(gòu)重塑、神經(jīng)重塑發(fā)生機制的研究.pdf

1、目的：本課題旨在研究持續(xù)快速起搏左心耳致犬慢性房顫（AF）模型心房電、結(jié)構(gòu)和神經(jīng)重塑，進一步探討心房電、結(jié)構(gòu)和神經(jīng)重塑參與慢性房顫發(fā)生與維持的作用機制。本研究包括：1）通過微創(chuàng)心臟外科腋下小切口開胸技術(shù)（MT）建立犬慢性心房顫動（AF）模型，探討微創(chuàng)心臟外科腋下小切口技術(shù)的可行性；2）建立犬慢性心房顫動（AF）模型，應用無創(chuàng)心電技術(shù)、心內(nèi)電生理技術(shù)以及MEA技術(shù)觀察慢性房顫心房電生理特性的改變，探討慢性房顫發(fā)生的電重塑機制；3）建立犬慢

2、性心房顫動（AF）模型，應用超聲心動圖及HE染色、PAS染色和Masson染色行組織學及電鏡檢查，觀察慢性房顫犬心房構(gòu)型、組織學及超微結(jié)構(gòu)的改變，闡明心房結(jié)構(gòu)重塑是慢性房顫發(fā)生與維持的重要機制；4）建立犬慢性心房顫動（AF）模型，應用短程心率變異（HRV）檢測、免疫組化染色技術(shù)及逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法，研究犬心臟自主神經(jīng)功能、心房神經(jīng)密度及神經(jīng)分布不均一性的改變，探討神經(jīng)重塑參與慢性房顫發(fā)生與維持的機制。
　　

3、方法：課題第一部分 14只健康比格犬隨機分為假手術(shù)組（n=7）和起搏組（n=7），假手術(shù)組植入起搏器不起搏，起搏組植入起搏器持續(xù)起搏8周。所有實驗犬應用微創(chuàng)心臟外科技術(shù)左側(cè)腋下小切口開胸術(shù)（MT）開胸，于左心耳縫植起搏電極，植入埋藏式動物實驗用的高頻起搏器（400次/min），持續(xù)快速起搏左心耳8周，建立犬慢性房顫模型。起搏組犬以400次/min連續(xù)起搏8周，誘發(fā)AF，假手術(shù)組植入起搏器不起搏。術(shù)后觀察犬的一般情況，定期監(jiān)測心電圖，記錄

4、犬的肢體導聯(lián)心電圖變化，觀察起搏器的工作情況及模型成功率。課題第二部分健康比格犬，應用微創(chuàng)心臟外科左側(cè)腋下小切口開胸術(shù)（MT），開胸植入起搏器建立犬慢性房顫模型，實驗過程中于起搏前、起搏后1、2、4、6、8周應用心臟電生理儀記錄并分析犬的體表心電圖各項指標變化?？焖倨鸩笮亩?周實驗終止時，經(jīng)頸內(nèi)靜脈將電極置入右心房，應用心內(nèi)電生理技術(shù)測定犬不同起搏周長刺激下的心房有效不應期（AERP300、AERP250和AERP200）。電生理指

5、標測定結(jié)束后，剪取左心耳組織切（片）塊，固定至MEA盤，記錄并分析快速起搏左心耳8周致犬慢性房顫的左心耳fAPD的變化及電激動的傳導。課題第三部分：健康比格犬，應用微創(chuàng)心臟外科左側(cè)腋下小切口開胸術(shù)（MT）開胸植入起搏器建立犬慢性房顫模型，于起搏前、起搏后1、2、4、6、8周，應用超聲心動儀測量各時段的左心房內(nèi)徑（LAD）。持續(xù)快速起搏犬左心耳8周實驗終止后，迅速開胸取心臟，剪下左心房，經(jīng)HE染色、PAS染色和Masson染色行組織學檢查

6、以及電鏡檢查觀察心房超微結(jié)構(gòu)的改變。課題第四部分：健康比格犬，應用微創(chuàng)心臟外科左側(cè)腋下小切口開胸術(shù)（MT），開胸植入起搏器建立犬慢性房顫模型，起搏前及快速起搏左心耳8周時，應用CARDIO VIEW心電工作站記錄犬的短程心率變異（HRV）各項指標觀察犬心臟自主神經(jīng)功能變化；用免疫組化染色技術(shù)檢測犬心臟自主神經(jīng)密度和再生情況，應用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）半定量測定心房神經(jīng)相關(guān)因子（生長相關(guān)蛋白GAP-43、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶CHAT

7、、酪氨酸羥化酶TH mRNA的表達。結(jié)果：課題第一部分所有14只實驗犬均應用微創(chuàng)心臟外科左側(cè)腋下小切口技術(shù)開胸，于左心耳縫植起搏電極，成功植入埋藏式動物實驗用的高頻起搏器（400次/min），手術(shù)過程順利。手術(shù)時間明顯縮短，犬無手術(shù)死亡及嚴重并發(fā)癥發(fā)生，術(shù)后恢復快。起搏組7只犬經(jīng)連續(xù)起搏8周期間，心電圖檢測可見起搏器信號，起搏器工作正常，而且可監(jiān)測到典型的AF心電圖改變。課題第二部分 1）成功建立并改良了犬慢性房顫模型的制作；2）心電圖

8、指標改變：與假手術(shù)組比較，起搏組犬P波平均時限于起搏4周時明顯延長[73.97±11.27 vs 52.68±5.67，（P＜0.01）]，起搏8周后進一步延長[82.90±10.01 vs 52.14±5.86，（P＜0.01）]；與假手術(shù)組比較，起搏組犬P波離散度于起搏4周時也明顯延長[15.47±1.14 vs 10.05±1.61，（P＜0.05）]，8周后較假手術(shù)組同一時間極顯著增加[36.77±5.92 vs 11.04±2

9、.21，（P＜0.01）]；3）心內(nèi)電生理指標改變：持續(xù)快速起搏左心耳8周后，假手術(shù)組在不同基礎刺激周長300，250，200ms時的AERP分別為（120.00±12.91、115.57±16.64和105.71±7.87）ms，AERP沒有顯著改變（P＞0.05）。起搏組AERP300、AERP250、AERP200、分別為（90.86±7.56、91.71±11.34和91.57±8.99）ms，與假手術(shù)組相比明顯縮短（P＜0.0

10、5），分別縮短了29.14ms、23.86ms和14.14ms；起搏組犬AERP頻率自適應性與假手術(shù)組相比明顯降低（P＜0.05），假手術(shù)組在不同基礎刺激周長作用下AERP及AERP頻率自適應性沒有顯著改變（P＞0.05）；4）MEA記錄系統(tǒng)顯示，LAA場電位形態(tài)與倒置心房肌AP的膜電位曲線相似，場電位信號的負相波幅度為（-215.43±18.75）μV，fAPD為（192.14±15.49）ms，快速起搏左心耳8周后，場電位信號的負相

11、波幅度為（-48.29±7.89）μV，fAPD為（164.29±7.87）ms，與正常假手術(shù)組相比，fAPD縮短了27.85ms（P＜0.01）；假手術(shù)組MEA記錄到電激動的傳導順序從左到右、左下到右上向外周緩慢遞減傳導，在傳導過程中場電位信號電壓逐漸遞減；而持續(xù)快速起搏左心耳8周后，電激動的傳導順序總體趨勢與假手術(shù)組一致，向外周傳導，但是電激動在傳導過程中電壓降低，電壓梯度樣改變消失。課題第三部分 1）超聲心動圖結(jié)果：與假手術(shù)組比較

12、，起搏組于起搏1周左心房內(nèi)徑（LAD）較顯著增加[22.98±1.53vs18.92±1.49，（P＜0.01）]，起搏8周時左心房內(nèi)徑增加明顯[28.11±1.62vs18.45±1.14，（P＜0.01）]；2）組織結(jié)構(gòu)改變：光鏡下假手術(shù)組心房肌的HE染色可見心肌細胞核大、清晰，心肌纖維縱行排列整齊，橫紋清楚；起搏組顯示心肌細胞核大小不規(guī)則，排列紊亂，心肌纖維走行方向各異，間隙增大，橫紋不清，胞漿空泡化，細胞腫脹；Masson染色結(jié)

13、果顯示，假手術(shù)組藍綠色膠原纖維，分布很少；起搏組可見膠原纖維增多，相互連接成網(wǎng)狀。PAS染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組PAS染色陰性，未發(fā)現(xiàn)有糖原積聚；起搏組可見明顯的深紫紅色糖原積聚；電鏡結(jié)果顯示，假手術(shù)組核膜光滑完整，核仁清晰，心肌纖維排列整齊，肌小節(jié)明暗帶清楚；起搏組心肌纖維排列明顯紊亂，線粒體增多，核周隙明顯增寬，核膜通透性增高。課題第四部分 1）心率變異（HRV）檢測結(jié)果：起搏組快速左心耳起搏8周后SDNN、RMSSD、PNN50三項

14、時域指標明顯降低，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；2）免疫組化結(jié)果：與假手術(shù)組相比，起搏組犬心房肌GAP43陽性神經(jīng)纖維、CHAT陽性神經(jīng)纖維和TH陽性神經(jīng)纖維平均密度均顯著增加；而且心房肌GAP43陽性神經(jīng)纖維、CHAT陽性神經(jīng)纖維和TH陽性神經(jīng)纖維分布不均一性也顯著增加；3）RT-PCR結(jié)果：與假手術(shù)組比較，起搏組犬心房肌GAP43、ChAT、TH mRNA的表達量增高，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

15、　　 結(jié)論：1）應用微創(chuàng)心臟外科腋下小切口技術(shù)開胸（MT）制作犬慢性房顫模型是安全可行的，犬無手術(shù)死亡及嚴重并發(fā)癥發(fā)生，術(shù)后恢復快，犬成活率高達100%。與常規(guī)標準切口開胸手術(shù)相比創(chuàng)傷明顯減小，值得在犬慢性房顫模型建立中推廣應用。2）持續(xù)快速起搏左心耳致犬慢性房顫模型引起心房電重塑，主要表現(xiàn)為心房除極時間（PT）、最大P波時限（Pmax）、P波離散度（Pd）延長，心房有效不應期（AERP）縮短，頻率自適應不良，場電位時程（fAPD）縮

16、短及電激動傳導的異質(zhì)性改變；MEA技術(shù)不僅能反映心肌組織場電位時程的改變，而且能更直觀地反映心肌傳導的各向異性，MEA技術(shù)能夠證實房顫的電生理改變，是檢測房顫電生理特性改變的可靠而有效的手段。3）持續(xù)快速起搏左心耳致犬慢性房顫模型心房結(jié)構(gòu)重塑以心房構(gòu)型、心房組織學及心房超微結(jié)構(gòu)的改變?yōu)樘攸c，表現(xiàn)為心房擴大、心肌細胞肥大、糖原積聚和膠原組織增生等病理結(jié)構(gòu)改變，即心房發(fā)生結(jié)構(gòu)重塑。說明持續(xù)快速起搏左心耳致犬慢性房顫模型，心房發(fā)生了結(jié)構(gòu)重塑現(xiàn)