應(yīng)用表達(dá)譜芯片技術(shù)研究甲強(qiáng)龍對小鼠神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖能力影響.pdf

1、研究背景與目的:
　　 脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病，也是骨科領(lǐng)域常見的疾病。近年來隨著交通和建筑業(yè)的發(fā)展，SCI的發(fā)生率每年都在上升，據(jù)統(tǒng)計(jì)，迄今為止全世界約有2500萬脊髓損傷患者，且每年新增病例超過13萬。根據(jù)我國2002年的一份調(diào)查顯示我國脊髓損傷發(fā)病率約為60/106，平均住院時(shí)間為189天，平均住院費(fèi)用約為27萬元。脊髓損傷的后果嚴(yán)重，輕者喪失勞動(dòng)能力，重者癱瘓

2、、大小便失禁、喪失生活自理能力，給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　 隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，干細(xì)胞特別是神經(jīng)干細(xì)胞在脊髓損傷領(lǐng)域的研究，給脊髓損傷的治療帶來了新的希望。近年來，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞在脊髓損傷修復(fù)中的作用，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞在脊髓損傷后的動(dòng)員調(diào)節(jié)機(jī)制成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。
　　 早在十余年前已有研究證實(shí)了脊髓內(nèi)存在能夠自我更新和多向分化的祖細(xì)胞，也即內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(Endogenous

3、 neural stem cells)。而進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究表明脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞絕大多數(shù)存在于室管膜和室管膜下區(qū)，并且研究顯示脊髓損傷后該區(qū)域的內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞會(huì)發(fā)生類似“激活”現(xiàn)象——快速增殖，并可以向損傷附近區(qū)域遷移，分化。進(jìn)一步研究表明，脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞可以發(fā)生遷移并逐漸分化為神經(jīng)系統(tǒng)的三種主要細(xì)胞：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞，且分化方向并不固定，而是由內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞所處的環(huán)境決定的。
　　 甲強(qiáng)龍是

4、目前常用的臨床治療急性脊髓損傷的藥物，大劑量甲潑尼龍注射治療(megadose of methylprednisolone，MP)，已經(jīng)被美國脊椎損傷協(xié)會(huì)(AmericanSpinal Injury Association，ASIA)列為SCI后的常規(guī)治療之一。甲強(qiáng)龍可抑制脊髓損傷后各種炎癥細(xì)胞的激活和增殖，減少各種炎癥因子及自由基的產(chǎn)生，從而降低損傷后炎癥反應(yīng)的水平，抑制脂質(zhì)過氧化作用，減輕繼發(fā)性損傷，保護(hù)神經(jīng)功能。然而隨著脊髓內(nèi)源性

5、神經(jīng)干細(xì)胞相關(guān)研究的深入，有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)甲強(qiáng)龍?jiān)诩顾钃p傷后的應(yīng)用不僅可以抑制炎癥細(xì)胞的激活等一些炎癥反應(yīng)，還會(huì)抑制脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖動(dòng)員，但就這一抑制作用的機(jī)制解釋尚未達(dá)成的共識。
　　 本研究的思路是用甲強(qiáng)龍干預(yù)體外培養(yǎng)的NSCs，與正常培養(yǎng)的NSCs對比，觀察其對體外培養(yǎng)的NSCs增殖的影響，并進(jìn)一步用表達(dá)譜芯片技術(shù)篩選受甲強(qiáng)龍影響表達(dá)發(fā)生變化的基因，從而進(jìn)一步研究甲強(qiáng)龍抑制NSCs增殖的可能機(jī)制。目前國內(nèi)外雖

6、然在該方面有研究，但研究較少，尚未達(dá)成共識，且本研究中采用小鼠全基因組表達(dá)譜芯片，能較為全面的篩選受藥物影響的表達(dá)發(fā)生變化的基因，為下一步分析甲強(qiáng)龍抑制NSCs增殖的機(jī)制提供比較全面科學(xué)的依據(jù)。本研究內(nèi)容包括三部分：第一部分：小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分離、體外培養(yǎng)和鑒定；第二部分：甲強(qiáng)龍對小鼠神經(jīng)干細(xì)胞體外增殖能力影響的實(shí)驗(yàn)研究；第三部分：應(yīng)用表達(dá)譜芯片技術(shù)研究甲強(qiáng)龍抑制神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力的可能機(jī)制。
　　 研究方法:
　　 取

7、孕14.5d胎鼠，顯微鏡下分離取出胚胎腦組織，剔除腦膜、血管，用DMEM/F12(添加EGF、bFGF、B27和肝素)培養(yǎng)基培養(yǎng)NSCs，細(xì)胞培養(yǎng)至第2代，常規(guī)進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定。用甲強(qiáng)龍干預(yù)體外培養(yǎng)的NSCs作為實(shí)驗(yàn)組，以正常培養(yǎng)的NSCs為對照，用顯微鏡觀察、細(xì)胞計(jì)數(shù)及CCK-8法在不同的時(shí)間點(diǎn)檢測細(xì)胞增殖狀態(tài)，判斷甲強(qiáng)龍對NSCs增殖能力的影響。繪制細(xì)胞增殖曲線并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。用甲強(qiáng)龍干預(yù)的NSCs和正常培養(yǎng)的NSCs作為實(shí)驗(yàn)組

8、和對照組，用Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA，樣本RNA進(jìn)行熒光標(biāo)記后，與小鼠全基因組表達(dá)譜芯片進(jìn)行雜交，然后進(jìn)行芯片掃描，數(shù)據(jù)處理與分析。了解受甲強(qiáng)龍影響表達(dá)發(fā)生變化的基因，分析推斷其影響NSCs增殖的可能機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 1.分離培養(yǎng)的細(xì)胞為懸浮呈神經(jīng)球樣生長，經(jīng)過免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定，Nestin染色陽性；5％胎牛血清誘導(dǎo)分化后，Tuj-1，O4，GFAP染色陽性，可以確定細(xì)胞為NSCs。
　　 2

9、.顯微鏡下觀察甲強(qiáng)龍對NSCs增殖能力的影響，可見加強(qiáng)龍組的NSCs增殖速度明顯不及對照組，細(xì)胞接種后第3～4d即可見明顯差別。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果同樣提示甲強(qiáng)龍干預(yù)后細(xì)胞增殖受到抑制，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組和對照組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CCK-8法檢測結(jié)果提示甲強(qiáng)龍可以導(dǎo)致NSCs增殖受抑制，且隨著藥物濃度的提高，該抑制作用逐漸增強(qiáng)。
　　 3.表達(dá)譜芯片檢測實(shí)驗(yàn)組和對照組RNA樣本，共得到的143個(gè)表達(dá)差異基因。其中110個(gè)表達(dá)上調(diào)基

10、因，明顯上調(diào)的有12個(gè)；33個(gè)表達(dá)下調(diào)基因，明顯下調(diào)的8個(gè)。表達(dá)下調(diào)的基因中內(nèi)皮素受體B(endothelin receptors B，EndrB)下調(diào)明顯，Ratio值為0.363。推斷EndrB下調(diào)為甲強(qiáng)龍抑制NSCs增殖的可能原因。
　　 結(jié)論:
　　 1.體外培養(yǎng)小鼠NSCs的方法簡單可行，細(xì)胞體外擴(kuò)增速度快，免疫細(xì)胞化學(xué)染色熒光信號明顯，可以確定細(xì)胞為NSCs。
　　 2.細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果和CCK-8法檢測