新型結(jié)構(gòu)PLGA-膠原三維可降解復合材料用于軟骨再生的效果研究.pdf

1、第一部分 PLGA/Collagen復合材料結(jié)構(gòu)設計與制備
　　目的：設計和制備新型結(jié)構(gòu)的PLGA/Collagen復合材料，使之更適合作為組織工程支架用于再生醫(yī)學研究。
　　方法：通過模具設計，控制PLGA/Collagen復合材料立體結(jié)構(gòu)，利用冷凍干燥技術將膠原多孔海綿復合于PLGA編織網(wǎng)膜上。材料按不同結(jié)構(gòu)分為三組：(1)THIN型，多孔膠原海綿形成于PLGA編織網(wǎng)膜的網(wǎng)孔中；(2)SEMI型，多孔膠原海綿形成于PLG

2、A編織網(wǎng)膜的網(wǎng)孔中和單側(cè)；(3)SANDWICH型，多孔膠原海綿形成于PLGA編織網(wǎng)膜的網(wǎng)孔中和兩側(cè)。材料制備完成后行掃描電鏡觀察材料表面和橫截面微觀結(jié)構(gòu)，利用圖像軟件統(tǒng)計孔徑大小，測定吸水率和膨脹率測定。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建THIN、SEMI、SANDWICH型PLGA/Collagen復合材料，表面孔徑分別為136.4±11.8μm、142.9±15.3μm和139.6±12.5μm；SEMI和SANDWICH型PLGA/Co

3、llagen復合材料吸水率分別為12.9±1.71和13.6±2.3倍，明顯優(yōu)于THIN型材料(4.4±0.4)(P<0.001)，結(jié)構(gòu)符合設計要求。
　　結(jié)論：新構(gòu)建的SEMI、SANDWICH型PLGA/Collagen復合材料結(jié)構(gòu)和表面孔徑滿足軟骨組織工程研究的需要；能為軟骨再生提供更大的細胞容納能力和組織再生空間。
　　第二部分 PLGA/Collagen復合材料用于軟骨再生的體外研究
　　目的：觀察和比較不同

4、結(jié)構(gòu)的THIN、SEMI、SANDWICH型PLGA/Collagen復合材料在體外對牛軟骨細胞增殖分泌的效果。
　　方法：分離與培養(yǎng)牛膝關節(jié)軟骨細胞(BACs)，倒置相差顯微鏡觀察細胞生長情況。擴增至第2代時接種至三種PLGA/Collagcn復合材料，(1)THIN/BACs組，細胞接種于THIN型PLGA/Collagen復合材料；(2)SEMI/BACs組，細胞接種于SEMI型PLGA/Collagen復合材料；(3)SA

5、NDWICH/BACs組，細胞接種于SANDWICH型PLGA/Collagen復合材料，檢測細胞接種效率。掃描電鏡觀察細胞在材料表面和內(nèi)部的生長情況；體外培養(yǎng)一周后檢測BACs/材料復合內(nèi)DNA和GAG含量，Real-time PCR檢測Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan mRNA表達強度。牛膝關節(jié)軟骨組織和體外單層培養(yǎng)一周的P1 BACs做對照。
　　結(jié)果：BACs成功地分離與擴增，生長與增殖情況良好；P2 BACs接種至P

6、LGA/Collagen復合材料，平均接種效率在SEMI、SANDWICH組分別為87.8±1.6％、95.6±2.2％，顯著高于THIN組(P<0.05)。掃描電鏡觀察BACs在PLGA/Collagen復合材料表面和中心生長活躍，分布均勻；一周后標本檢測DNA含量SEMI、SANDWICH組顯著高于THIN組(P<0.05)，但GAG含量與無明顯差異。三組細胞/材料復合物Ⅱ型膠原和Aggrecan mRNA表達強度均顯著高于體外單純

7、培養(yǎng)的BACs，但SEMI、SANDWICH組與THIN組相比亦無顯著統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：PLGA/Collagen復合材料具備優(yōu)秀的生物相容性；SEMI、SANDWICH組的結(jié)構(gòu)設計顯著地提高BACs在PLGA/Collagen復合材料上的接種效率；SEMI、SANDWICH組較THIN組明顯促進透明軟骨樣ECM成分分泌。
　　第三部分 PLGA/Collagen復合材料用于軟骨再生的體內(nèi)研究
　　目的：觀察和比

8、較不同結(jié)構(gòu)的THIN、SEMI、SANDWICH型PLGA/Collagen復合材料在體內(nèi)對牛軟骨細胞成軟骨的效果。
　　方法：P2 BACs接種至THIN、SEMI、SANDWICH型PLGA/Collagen復合材料，(1)THIN/BACs組，細胞接種于THIN型復合材料；(2)SEMI/BACs組，細胞接種于SEMI型復合材料；(3)SANDWICH/BACs組，細胞接種于SADWICH型復合材料；(4)對照組，隨機選擇空

9、白THIN、SEMI、SANDWICH型復合材料，體外軟骨細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后植入裸鼠背部皮下。2、4、8周后取出行標本大體觀察，厚度測量。檢測新生軟骨樣組織內(nèi)DNA和GAG含量，Real-time PCR檢測Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原、Aggrecan mRNA表達強度；對標本縱切面和橫切面行組織學和免疫組織化學檢測；并以生物力學方法評估標本的彈性模量和剛度。牛膝關節(jié)軟骨組織做對照。
　　結(jié)果：2、4、8周后取出標本，三組BACs/材料

10、復合物均呈透明軟骨樣外觀而空白對照組至第8周時基本被吸收。SEMI/BACs、SANDWICH/BACs組新生軟骨的厚度分別為THIN/BACs組的1.66和1.73倍(P<0.05)。三組標本的DNA含量非常接近，但SEMI/BACs、SANDWICH/BACs組μgDNA的GAG含量顯著地高于THIN/BACs組(p<0.05)，分別為牛膝關節(jié)軟骨標本的60.1％、52.1％和26.6％。Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)標本內(nèi)Ⅱ型

11、膠原、Aggrecan mRNA表達強度隨移植時間進行性上升，而Ⅰ型膠原mRNA表達強度進行性下降；組織學和免疫組化染色發(fā)現(xiàn)細胞分布均勻，大量透明軟骨樣ECM形成。SEMI/BACs、SANDWICH/BACs組標本的彈性模量分別達到了牛膝關節(jié)軟骨的54.8％、49.3％，剛度達到了68.8％、62.7％。
　　結(jié)論：PLGA/Collagen復合材料植入裸鼠體內(nèi)后呈現(xiàn)了優(yōu)秀的生物相容性；新設計的SEMI和SANDWICH材料較T