Zonulin在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的作用研究與甘氨鵝脫氧膽酸細(xì)胞毒性的體外實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景:
　　本論文包括兩個(gè)部分的內(nèi)容。
　　第一部分:zonulin在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制中的作用研究
　　動(dòng)脈粥樣硬化的形成機(jī)制一直是心血管疾病研究的焦點(diǎn)之一。除了內(nèi)皮損傷學(xué)說,泡沫細(xì)胞形成機(jī)制與平滑肌細(xì)胞增生理論等經(jīng)典觀點(diǎn)以外,越來越多的證據(jù)顯示機(jī)體持續(xù)慢性系統(tǒng)炎癥狀態(tài)與動(dòng)脈粥樣硬化的形成密切相關(guān),最近針對腸道菌群與冠心病發(fā)病之間聯(lián)系的報(bào)道也為粥樣硬化的形成機(jī)制提供了新的觀點(diǎn)。腸道菌群通過何種機(jī)制參與動(dòng)脈粥樣硬

2、化形成,其促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化形成依賴于何種條件,以及在與此相關(guān)的發(fā)病機(jī)制中是否存在可供干預(yù)的靶點(diǎn)成為最近粥樣硬化機(jī)制研究的熱點(diǎn)問題。
　　研究報(bào)道在粥樣硬化斑塊中檢測到細(xì)菌DNA,其中部分為腸源性細(xì)菌產(chǎn)物。針對慢性牙周炎患者患冠心病的機(jī)制研究也提示反復(fù)菌血癥能顯著增加冠心病發(fā)病率。如能明確細(xì)菌是否參與無明顯反復(fù)感染患者的動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制,并進(jìn)一步了解細(xì)菌如何進(jìn)入人體并參與動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制,可為粥樣硬化形成機(jī)制的細(xì)菌學(xué)說提

3、供更多的證據(jù)。在此基礎(chǔ)上尋找可干預(yù)細(xì)菌進(jìn)入人體的關(guān)鍵環(huán)節(jié),試通過對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)減少細(xì)菌進(jìn)入人體的機(jī)會(huì),將為預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化提供新的思路。
　　Zonulin是腸道上皮細(xì)胞合成的一種功能蛋白,能夠通過調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的結(jié)構(gòu)而改變腸上皮間隙的通透性。研究發(fā)現(xiàn)克隆病患者中存在腸道zonulin水平升高與患冠心病幾率增加的并存現(xiàn)象,如果zonulin水平升高可增加患冠心病的機(jī)會(huì),那么zonulin很可能通過調(diào)節(jié)腸道上

4、皮屏障的通透性而增加細(xì)菌進(jìn)入人體的機(jī)會(huì)。為此,本研究用WesternBlot方法研究動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中Zonulin的表達(dá)水平改變,用基于細(xì)菌16srDNA的高通量測序方法尋找無反復(fù)感染動(dòng)脈粥樣硬化患者血液中的細(xì)菌DNA產(chǎn)物,并試圖在體外建立的腸上皮細(xì)胞屏障模型中研究部分細(xì)菌通過腸上皮屏障的機(jī)制。通過上述研究尋找腸道細(xì)菌與動(dòng)脈粥樣硬化形成的具體聯(lián)系機(jī)制,以期為動(dòng)脈粥樣硬化的診治提供新的思路。
　　第二部分:甘氨鵝脫氧膽酸細(xì)胞毒

5、性的體外實(shí)驗(yàn)研究
　　妊娠肝內(nèi)膽汁淤積綜合征(intrahepaticcholestasisofpregnancyICP)是一組妊娠合并癥,發(fā)病率因地而異,在長江流域地區(qū)可高達(dá)4-6％,是該地區(qū)危害母嬰健康的重要妊娠期疾病。膽酸對于母親與胎兒的損傷成為ICP母嬰損害的主要原因。機(jī)體內(nèi)生理濃度范圍內(nèi)的膽酸對細(xì)胞及組織并無毒性作用,但是膽酸升高到一定濃度時(shí),可以產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性。膽酸對于細(xì)胞的損傷主要以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡為主,其中最常見的

6、是細(xì)胞凋亡。近期研究發(fā)現(xiàn)膽酸還可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生壞死,甚至可能是最近才報(bào)道的程序性壞死。研究膽酸對于循環(huán)及呼吸系統(tǒng)主要功能細(xì)胞的細(xì)胞毒性,有助于從細(xì)胞水平闡明膽酸對于循環(huán)及呼吸系統(tǒng)的功能損害及其分子機(jī)制,為揭示ICP相關(guān)的子代心肺損傷提供理論基礎(chǔ)。
　　ICP患者子代并發(fā)癥中,以早產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)窘迫以及新生兒肺損傷最為常見,危害也最大。早產(chǎn)是一系列新生兒并發(fā)癥的重要原因,胎兒宮內(nèi)窘迫則是造成子代神經(jīng)功能損傷的主要原因之一。膽酸對于胎兒

7、血管結(jié)構(gòu)及功能的影響可能是ICP相關(guān)早產(chǎn)與宮內(nèi)窘迫的發(fā)病機(jī)制。在胎兒血管結(jié)構(gòu)中,與母兒循環(huán)中膽酸最直接接觸的是血管內(nèi)皮細(xì)胞。而膽酸對于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)是否具有損傷作用目前尚未見報(bào)道。膽酸誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞損傷主要與ICP相關(guān)的新生兒肺損傷有關(guān):當(dāng)母親患有ICP時(shí),孕婦血中膽酸水平明顯增高,羊水及胎兒血中膽酸亦相應(yīng)升高,膽酸長時(shí)間浸潤并損傷肺組織,是ICP致新生兒肺損傷的關(guān)鍵因素?；贏ECⅡ在肺部的重要作用,研究膽酸對AE

8、CⅡ的細(xì)胞毒性作用將可能為ICP新生兒肺損傷作出解釋。
　　甘氨鵝脫氧膽酸(Glycochenodeoxycholate,GCDC)是膽酸的一種類型,被發(fā)現(xiàn)有強(qiáng)烈的誘導(dǎo)細(xì)胞死亡作用,可誘導(dǎo)肝細(xì)胞等一系列細(xì)胞死亡。但目前尚未見GCDC誘導(dǎo)HUVEC與AECⅡ死亡的報(bào)道。
　　研究目的:
　　1.檢測動(dòng)脈粥樣硬化患者血清Zonulin的表達(dá)水平改變。
　　2.在動(dòng)脈粥樣硬化患者循環(huán)中尋找腸道細(xì)菌DNA產(chǎn)物并鑒定。

9、r>　　3.建立腸上皮細(xì)胞屏障體外模型并以此為基礎(chǔ)研究細(xì)菌通過腸上皮屏障的機(jī)制。4.明確GCDC能否誘導(dǎo)HUVEC與AECⅡ細(xì)胞死亡,及其誘導(dǎo)死亡的具體機(jī)制。5.研究GCDC對HUVEC與AECⅡ結(jié)構(gòu)與功能的影響。
　　材料方法:
　　1.采用WesternBlot方法檢測動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中的Zonulin表達(dá)變化。
　　2.用基于ROCHE454平臺(tái)的細(xì)菌16srDNA的高通量測序方法尋找無反復(fù)感染動(dòng)脈粥樣硬化患

10、者血液中的細(xì)菌DNA產(chǎn)物。
　　3.以Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合Transwell方法建立腸上皮細(xì)胞屏障體外模型,用電鏡及激光共聚焦等方法觀察細(xì)菌通過該屏障的具體機(jī)制。
　　4.采用DAPI染色,流式細(xì)胞學(xué)annexinV/PI染色分析,活性caspase3酶免疫熒光染色等方法檢測GCDC誘導(dǎo)HUVEC與AECⅡ細(xì)胞凋亡與壞死情況。
　　5.用Real-timePCR等法觀察GCDC對HUVEC與AECⅡ結(jié)構(gòu)與功能的影響

11、。
　　結(jié)果:
　　1.動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中存在Zonulin,且其表達(dá)水平顯著高于對照組。Westernblot結(jié)果顯示:zonulin為分子量約47KD的蛋白分子,血清中檢測到與陽性對照腸上皮細(xì)胞中位置相同的條帶,且分子量符合zonulin特征。動(dòng)脈粥樣硬化患者與正常對照相比較,血清zonulin的表達(dá)增高(n=8,P<0.05)。
　　2.無感染表現(xiàn)的動(dòng)脈粥樣硬化患者血液中檢測到細(xì)菌16srDNA產(chǎn)物。高通量測

12、序結(jié)果顯示多種腸道來源的細(xì)菌16srDNA在無感染表現(xiàn)的動(dòng)脈粥樣硬化患者血液中檢測出,其中以拉恩氏菌屬、沙雷氏菌屬與熒光假單胞菌屬含量最高。
　　3.體外成功建立了腸上皮細(xì)胞屏障模型,微小腸道細(xì)菌可能主要從細(xì)胞間隙通過腸道上皮屏障。Caco-2細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)21d后分化成熟,細(xì)胞間緊密連接形成,跨上皮細(xì)胞電阻值顯著升高,形成細(xì)胞屏障。粘質(zhì)沙雷氏菌可在不損害細(xì)胞的條件下通過腸上皮細(xì)胞屏障。
　　4.采用細(xì)胞原代培養(yǎng)方法,體外成功培

13、養(yǎng)出HUVEC與新生大鼠AECⅡ細(xì)胞。并對所培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行了特異性鑒定。GCDC在體外能夠誘導(dǎo)原代培養(yǎng)的新生鼠肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞(AECII)死亡,包括凋亡和壞死。GCDC誘導(dǎo)的AECII死亡具有濃度依賴性,線粒體形態(tài)與功能變化參與細(xì)胞死亡過程。
　　5.GCDC處理的HUVEC出現(xiàn)ET-1的水平變化,3d內(nèi)以降低ET-1為主,長時(shí)間處理后ET-1的變化反而升高。GCDC可有效抑制中AECⅡ肺表面活性物質(zhì)的分泌。GCDC處理后的AEC

14、Ⅱ出現(xiàn)肺表面活性物質(zhì)含量的降低。
　　結(jié)論:
　　1.腸道部分微小體積菌群可能參與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制,其可能經(jīng)腸上皮細(xì)胞間隙通過腸上皮細(xì)胞屏障。
　　2.Zonulin在動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中表達(dá)升高,可能與其具有調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞間緊密連接通透性功能有關(guān)。
　　3.ICP相關(guān)新生兒肺損傷的發(fā)病機(jī)制包括GCDC誘導(dǎo)AECⅡ發(fā)生凋亡與壞死,以及GCDC抑制AECⅡ肺表面活性物質(zhì)分泌。
　　4.ICP相關(guān)的早產(chǎn)