S100A2基因與FAM3B基因在胃癌發(fā)病中的功能研究.pdf

1、胃癌是消化系統(tǒng)病死率較高的惡性腫瘤之一，主要依賴手術(shù)及化療等綜合手段進行治療，整體療效尚不滿意，對胃癌的早期診斷依然是提高患者生存率的關(guān)鍵。由于惡性腫瘤各種基因和蛋白等分子之間存在錯綜復(fù)雜的聯(lián)系，對胃癌的發(fā)生發(fā)展以及浸潤轉(zhuǎn)移等機制尚無充分的認識，腫瘤標(biāo)志物和基因治療的研究依然是胃癌研究中的難點。我室在前期的研究中，發(fā)現(xiàn)S100A2與FAM3B基因在胃癌組織與癌旁正常組織之間的表達存在明顯的差別.本課題旨在進一步深入了解這兩個基因在胃癌發(fā)

2、病中可能存在的作用，探討這兩個基因在細胞系中的生物學(xué)功能. 目的：研究S100A2與FAM3B基因的細胞生物學(xué)功能，探討其在胃癌發(fā)病中的意義. 方法： 1、應(yīng)用RT-PCR和Western blot以及細胞免疫化學(xué)技術(shù)，從mRNA和蛋白水平檢測胃正常上皮細胞系GES-1與胃癌細胞系SGC7901、BGC823和MGC803等細胞系中S100A2與FAM3B的表達情況. 2、應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，從胃癌癌旁

3、正常組織中擴增S100A2與FAM3B全長基因，構(gòu)建真核表達載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細胞BGC823，激光共聚焦顯微鏡觀察S100A2、FAM3B與EGFP融合蛋白在胃癌細胞內(nèi)的亞細胞分布. 3、經(jīng)轉(zhuǎn)染S100A2和FAM3B重組質(zhì)粒的BGC823細胞，用G418篩選獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。通過HE染色、MTT、穿膜實驗以及細胞周期和Cleared PARP的檢測，分析轉(zhuǎn)染目的基因細胞株與空載體細胞株在細胞形態(tài)、增殖速度、運動能力、

4、對細胞周期的影響以及細胞凋亡等方面是否存在差異，從而推測目的基因的細胞生物學(xué)功能。 結(jié)果： 1、S100A2 mRNA和蛋白在胃癌細胞系中表達降低；而FAM3B mRNA和Western blot雖然在4株細胞系無明顯差異，但細胞免疫化學(xué)顯示：GES-1細胞中表達較多，BGC823表達中等，SGC7901細胞表達明顯減少. 2、從胃癌癌旁正常組織中成功擴增出S100A2與FAM3B全長基因并克隆入真核表達載體p

5、EGFP-N2中的多克隆位點上，經(jīng)PCR、酶切反應(yīng)和測序證實正確。目的基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細胞BGC823，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，S100A2與EGFP融合蛋白分布在細胞漿內(nèi)核膜周圍，而FAM3B融合蛋白則位于細胞核內(nèi)。 3、經(jīng)過G418篩選，成功獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株，經(jīng)Western blot檢驗證實S100A2扣FAM3B在轉(zhuǎn)染細胞中表達增加。 4、HE染色發(fā)現(xiàn)胃癌細胞BGC823與轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后BGC823細胞

6、的細胞形態(tài)沒有發(fā)生明顯變化；轉(zhuǎn)染S100A2與FAM3B重組質(zhì)粒后，G0/G1期細胞比例增高，S期和G2/M期比例降低；轉(zhuǎn)染S100A2和FAM3B重組質(zhì)粒后，BGC823細胞的增殖速度明顯降低，尤其以FAM3B基因的影響較為明顯；轉(zhuǎn)染S100A2后，細胞在單位時間內(nèi)穿過Transwell的數(shù)量明顯多于空載體組，具有顯著差異性(P＜0.05)；通過檢測PARP蛋白的被caspase切割情況，發(fā)現(xiàn)S100A2與FAM3B基因轉(zhuǎn)染后，細胞內(nèi)

7、89KDa片段明顯增多。 結(jié)論： 1、S100A2基因在胃癌細胞系表達降低，表明該基因可能具有抑癌基因的作用。在細胞漿內(nèi)表達，但靠近核膜周圍。轉(zhuǎn)染后細胞生長增殖速度減慢，增殖指數(shù)降低，參與細胞凋亡，但運動能力增強，提示S100A2基因可能通過不同的機制參與了細胞的生長、運動和凋亡。 2、FAM3B基因mRNA和蛋白在4株細胞系表達均較弱，雖無明顯差異，但細胞化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)GES-1細胞系與胃癌細胞系BGC823表達