攜載基質(zhì)金屬蛋白酶小干擾RNA殼聚糖納米微球防止體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞退變的研究.pdf

1、背景：
　　軟骨組織工程中，體外擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞極易發(fā)生去分化，表現(xiàn)為細(xì)胞表型消失，合成細(xì)胞外基質(zhì)能力下降?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo-proteinase,MMP）是一組廣泛存在于各種組織、可降解細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白酶，與軟骨細(xì)胞去分化、軟骨退變關(guān)系密切。RNA干擾（RNA interference,RNAi）是指將與靶基因同源序列的雙鏈RNA導(dǎo)入細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)與靶基因的信使RNA（messenger RNA,mRN

2、A）結(jié)合并迅速將其降解，從而抑制該基因表達(dá)。殼聚糖(chitosan,CS)是一種帶正電荷的大分子，在一定條件下可與帶負(fù)電荷的核酸結(jié)合，形成納米級(jí)別的聚合物可被細(xì)胞胞吞。本研究擬使用攜載MMP-3和13的小干擾RNA（small interfering RNA,siRNA）質(zhì)粒的殼聚糖納米微粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的種子細(xì)胞，試圖抑制去分化相關(guān)基因表達(dá)，培養(yǎng)出表型優(yōu)良、穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞，防止再生軟骨細(xì)胞退變。
　　實(shí)驗(yàn)一:軟骨細(xì)胞的體外培養(yǎng)與

3、鑒定
　　目的：通過體外培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，觀察軟骨細(xì)胞的形態(tài)、體外培養(yǎng)時(shí)維持細(xì)胞表型的能力，選出最適合作軟骨組織工程的種子細(xì)胞。方法：利用貫序酶消化法分離兔關(guān)節(jié)軟骨，體外培養(yǎng)，并利用組織學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)等方法鑒定、評價(jià)軟骨細(xì)胞功能。結(jié)果：利用胰酶-膠原酶貫序消化法，可成功消化兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，并成功培養(yǎng)。用HE、甲苯胺藍(lán)、番紅-O等組織學(xué)染色方法予以鑒定，Ⅰ、Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察軟骨細(xì)胞功能。結(jié)論：通過體外培養(yǎng)，原代至第3代

4、的軟骨細(xì)胞維持表型的能力無明顯差異，適合做組織工程的種子細(xì)胞，第4代以后發(fā)生去分化、分泌Ⅱ型膠原的能力顯著減低。
　　實(shí)驗(yàn)二:攜載質(zhì)粒的納米微球轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞
　　目的：研究攜載質(zhì)粒的不同分子量的殼聚糖納米微球的包裹率和保護(hù)DNA的能力，鏡下觀察其大小和形態(tài)，觀察其對原代兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。方法：用分子量在5K到800K之間的六種殼聚糖，利用表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白質(zhì)粒(plasmid Enhanced G

5、reen Florescence Protein,pEGFP)作報(bào)告基因，通過復(fù)合凝聚法制備殼聚糖-質(zhì)粒納米微球。觀察殼聚糖納米微球介導(dǎo)pEGFP在體外培養(yǎng)的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)情況；并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果：分子量為170K、250K和800K的殼聚糖納米微球的轉(zhuǎn)染效率均高于5K、50K和85K的殼聚糖納米微球，其中800K的殼聚糖納米微球與脂質(zhì)體相當(dāng)。結(jié)論：與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組相比，氮/磷（Nitrogen/Phosphate,N/P）比值

6、為5時(shí)，相對分子量為800k的殼聚糖納米微球可高效轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞，可作為今后進(jìn)一步體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的首選轉(zhuǎn)染載體。
　　實(shí)驗(yàn)三:攜載MMP3、13-shRNA的殼聚糖納米微球轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞
　　目的：通過利用攜載MMP3、13-shRNA的殼聚糖納米微球體外轉(zhuǎn)染原代兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，利用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real-time quantitative Polymerase Chain Reaction

7、,qRT-PCR）檢測基因干擾效果，并與陰性對照組比較。方法：利用分子量800K的殼聚糖制作攜載MMP3、13的shRNA的殼聚糖納米微球，N/P比值為5，體外轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，設(shè)立隨即核酸序列作為陰性對照。利用qRT-PCR檢測干擾效率。結(jié)果：攜載MMP-3和13基因的siRNA質(zhì)粒的殼聚糖納米微球能成功轉(zhuǎn)染兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，其干擾MMP表達(dá)的效率均可達(dá)20％左右，并顯著高于陰性對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論