抗血管生成促肝癌轉(zhuǎn)移中IL-12b介導(dǎo)的機體免疫起關(guān)鍵作用.pdf

1、晚期肝細(xì)胞癌(簡稱“肝癌”)在臨床上常見，以索拉非尼為代表的抗血管生成藥物在晚期肝癌治療中占重要地位，但其生存期延長有限且多數(shù)患者因各種原因需要停藥。有報道稱，短期抗血管生成治療后停藥具有促進腫瘤轉(zhuǎn)移的潛能。我們前期的動物實驗也發(fā)現(xiàn)，索拉非尼在顯示療效的同時，促進肝癌局部播散和血道轉(zhuǎn)移，腫瘤內(nèi)巨噬細(xì)胞在其中起重要作用。盡管越來越多的研究提示抗血管生成存在治療耐藥和促進腫瘤轉(zhuǎn)移等負(fù)面作用，但多集中以腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的變化來解釋該作用。

2、本研究擬在機體內(nèi)環(huán)境方面，揭示兩種典型的血管內(nèi)皮生長因子受體抑制劑(索拉非尼和蘇尼替尼)的作用，了解該作用對肝癌轉(zhuǎn)移的影響，揭示其機制并尋求潛在的聯(lián)合治療，以減少其負(fù)面作用，從而為抗血管生成治療增效或減少停藥后的反跳。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)：
　　1.為充分暴露藥物對機體內(nèi)環(huán)境的作用，我們使用藥物預(yù)處理模型，即在接種腫瘤前用藥，接種腫瘤后停藥?？寡苌伤幬镱A(yù)處理不影響原位種植肝癌的生長，但可顯著促進原位種植的肝癌或尾靜脈注射肝癌細(xì)胞

3、的肺轉(zhuǎn)移。這與Ebos等(Ebos，et al.Cancer Cell2009)的報道一致。在我們的研究體系中，只有動物的機體暴露于藥物，腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織未受到藥物的直接影響。我們推測，藥物可引發(fā)裸鼠機體發(fā)生某種變化，該變化促進了后來進入體內(nèi)的肝癌細(xì)胞的肺轉(zhuǎn)移。
　　2.使用抗體芯片篩選動物血漿中濃度顯著變化的常見炎癥因子和血管生成因子，發(fā)現(xiàn)藥物干預(yù)使外周血血漿白介素(IL)-12b(IL-12的一個亞基，又稱IL-12p40)

4、濃度顯著下降，使用ELISA方法驗證了該結(jié)果。
　　3.確定IL-12b的器官來源：取動物的腎、肝、脾、肺4個主要臟器，發(fā)現(xiàn)這些臟器的il-12b表達(dá)均被藥物治療所抑制，其中脾臟il-12b的表達(dá)豐度最高。
　　4.確定IL-12b的細(xì)胞來源：磁珠分選小鼠脾臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)，發(fā)現(xiàn)這兩種細(xì)胞是il-12b的主要來源(分選后剩余的其他細(xì)胞il-12b的表達(dá)量較低)。這與傳統(tǒng)認(rèn)識一致，即抗原提呈細(xì)胞是表達(dá)IL-1

5、2的主要細(xì)胞類型。
　　5.選擇體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞為主要的研究對象，抗血管生成藥物在體外可顯著抑制THP-1單核-巨噬細(xì)胞株的il-126表達(dá)；在此基礎(chǔ)上，我們探索在藥物預(yù)處理促進肝癌轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象中，IL-12b表達(dá)降低是否是關(guān)鍵原因。
　　6.IL-12b的水平下降是否有促轉(zhuǎn)移作用
　　1)脾臟切除：脾臟il-12b表達(dá)量最高，切脾后的動物外周血血漿il-12b濃度明顯低于同期的接受假手術(shù)的小鼠。對切脾后的裸鼠尾靜脈注

6、射肝癌細(xì)胞，可觀察到該組動物肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移增加；
　　2)小鼠IL-12b中和抗體腹腔注射亦可促進尾靜脈肝癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移。這兩個實驗均重現(xiàn)了抗血管生成藥物的促肝癌肺轉(zhuǎn)移作用。
　　7.IL-12b表達(dá)的下降如何促進肺轉(zhuǎn)移：體外實驗發(fā)現(xiàn)，重組IL-12b對腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力無明顯影響；現(xiàn)有知識也提示IL-12主要通過自然殺傷細(xì)胞(NK)的細(xì)胞毒作用起間接的抗腫瘤作用(Trinchieri，Nat Rev Immunol20

7、03)。我們采用流式細(xì)胞儀檢測NK的干擾素(IFN)-γ表達(dá)，可觀察到了抗血管生成藥物可以顯著抑制動物外周血NK細(xì)胞的IFN-γ表達(dá)。這提示，抗血管生成藥物可能通過抑制IL-12b的表達(dá)，間接抑制NK細(xì)胞的免疫殺傷作用。
　　8.臨床研究發(fā)現(xiàn)，癌周肝臟組織內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤較多或巨噬細(xì)胞集落刺激因子表達(dá)較高的患者，接受根治性切除術(shù)后預(yù)后不佳。巨噬細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子是獨立預(yù)測患者死亡和復(fù)發(fā)的危險因素。
　　9.潛在干預(yù)：如

8、上結(jié)果提示，針對巨噬細(xì)胞的靶細(xì)胞的干預(yù)存在一定的治療價值。藥物干預(yù)增強巨噬細(xì)胞的抗腫瘤作用有望為抗血管生成藥物增效，臨床研究的結(jié)果甚至提示，即使單純干預(yù)巨噬細(xì)胞的功能亦可能抑制肝癌轉(zhuǎn)移。再者，多個報道顯示唑來膦酸可通過促進巨噬細(xì)胞和DC的抗腫瘤免疫，我們前期的研究(Zhang，et al.Clin Cancer Res2010)也提示唑來膦酸在免疫微環(huán)境方面與索拉非尼有協(xié)同作用。我們選取唑來膦酸為進一步的聯(lián)合干預(yù)。動物實驗發(fā)現(xiàn)，唑來膦酸

9、可以逆轉(zhuǎn)抗血管生成藥物引起的脾臟il-12b表達(dá)下降。體外實驗亦發(fā)現(xiàn)，唑來膦酸在特定濃度時可以逆轉(zhuǎn)蘇尼替尼對THP-1細(xì)胞的il-12b表達(dá)抑制作用。在抗血管生成藥物預(yù)處理時，聯(lián)用唑來膦酸可以抑制抗血管生成藥物治療對肝癌肺轉(zhuǎn)移的促進。
　　結(jié)論：抗血管生成治療可以抑制機體，特別是巨噬細(xì)胞的IL-12b的表達(dá)，該作用介導(dǎo)抗血管生成治療促進肝癌轉(zhuǎn)移的潛能。針對其干預(yù)可有望成為抗血管生成藥物的聯(lián)合治療或停藥后的替代治療，以期減少抗血管生

10、成治療的負(fù)面作用，提高療效。
　　應(yīng)用價值：
　　1.以往研究抗血管生成治療的促癌轉(zhuǎn)移作用的機制，多用腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的變化來解釋；而本文發(fā)現(xiàn)藥物可引起機體內(nèi)環(huán)境變化，尤其是免疫力的變化，是更為關(guān)鍵的因素。這提示，患者在接受靶向VEGFR的抗血管生成治療時，患者的機體免疫變化值得關(guān)注。
　　2.首次篩選并驗證了參與促癌轉(zhuǎn)移作用的關(guān)鍵分子IL-12b，且巨噬細(xì)胞是其主要來源，以后者為靶細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)臨床可用的藥物(唑來膦

11、酸)可以逆轉(zhuǎn)其功能，從而減少抗血管生成治療的負(fù)面作用，提高其臨床療效。
　　創(chuàng)新點：
　　1.以往有研究探索抗血管生成的促轉(zhuǎn)移的負(fù)面作用，但多使用腫瘤細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境的變化來解釋該負(fù)面作用。本研究揭示了機體內(nèi)環(huán)境在接受治療時的變化，并闡述了機體的變化參與構(gòu)成抗血管生成藥物的促轉(zhuǎn)移負(fù)面作用，豐富了抗血管生成治療耐藥的機制。
　　2.篩選獲得并驗證了參與促成負(fù)面作用的關(guān)鍵分子IL-12b，并發(fā)現(xiàn)唑來膦酸可針對該分子進行干預(yù)