胎盤生長因子介導小細胞肺癌細胞穿過血腦屏障的體內(nèi)研究.pdf

1、目的：
　　 流行病學調(diào)查表明，大約有10％～30％的癌癥患者發(fā)生腫瘤腦轉(zhuǎn)移，我國每年的新增腦轉(zhuǎn)移瘤病例大約為1.7萬。在各種腦轉(zhuǎn)移腫瘤中以肺癌腦轉(zhuǎn)移居多，約占全部病例的30％，其中小細胞型肺癌（smallcelllungcancer，SCLC）具有惡性度高，腦轉(zhuǎn)移發(fā)生時間早的特點。大約有50％的小細胞肺癌患者發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，其中有10％～20％的患者以腦部轉(zhuǎn)移瘤形成為疾病的首發(fā)癥狀，而80％的患者在確診后兩年發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，病人的致死

2、、致殘率高，預后差。因此，探討小細胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的分子機制對于小細胞肺癌的防治具有重要的意義。
　　 腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復雜多步驟的病理過程，器官血管壁的通透性將影響腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。腦的血管系統(tǒng)具有特殊的血腦屏障（blood-brainbarrier，BBB）結(jié)構(gòu)，這個屏障在一定程度上可以阻止致病因子對腦的侵害，但是小細胞肺癌向器官轉(zhuǎn)移表現(xiàn)出對腦的“親嗜性”，這一病理特點提示小細胞肺癌可能具有影響血腦屏障通透性的腫瘤特性。近年的研究發(fā)

3、現(xiàn)了一些與小細胞肺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因（如PreproGRP和NMB-R），并且發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)移與肺癌細胞表面的酪氨酸激酶受體活性增高有關(guān)。本室研究發(fā)現(xiàn)，在小細胞肺癌細胞穿過人腦微血管內(nèi)皮細胞（humanbrainmicrovascularendothelialcells，HBMEC）過程中激活了Rho/ROCK通路，使actin細胞骨架重排，破壞HBMEC間緊密連接（tightjunction，TJ）的完整性，從而促進小細胞肺癌細胞穿過血腦屏

4、障（FEBSletters，2006，580:4252-4260）。
　　 近年來，血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）與惡性腫瘤的關(guān)系受到重視，發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤組織VEGF表達上調(diào)，不僅能促進腫瘤血管形成、促進腫瘤生長，還能通過促進血管的滲透性來加速腫瘤組織細胞進出血管，因而加速了腫瘤的轉(zhuǎn)移。胎盤生長因子（placentalgrowthfactor，PLGF）是血管內(nèi)皮細胞生

5、長因子（VEGF）家族中的一員，多在病理條件下發(fā)揮生物學功能。在腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，PLGF主要通過促進腫瘤血管的新生而影響腫瘤的增殖。PLGF可以通過與VEGFR-1/Flt-1受體結(jié)合，協(xié)同VEGF發(fā)揮血管生成的作用。此外，還可以募集循環(huán)中的造血干細胞和單核細胞到腫瘤原發(fā)灶，促進腫瘤血管的增殖。近來的研究表明，PLGF在腫瘤發(fā)生中具有雙重作用，一可以直接作用于腫瘤細胞而影響腫瘤細胞的遷移，二可以作用于血管內(nèi)皮細胞影響其功能。本室進一步研

6、究發(fā)現(xiàn)PLGF在小細胞肺癌細胞穿過BBB過程中發(fā)揮了重要作用，其與腦微血管內(nèi)皮細胞上的VEGFR-1/Flt-1受體相結(jié)合，引發(fā)下游信號通路，激活Rho/ROCK通路，進一步使細胞骨架系統(tǒng)重排、緊密連接破壞，從而使腫瘤細胞穿過血腦屏障。
　　 本研究主要是在前期研究的基礎(chǔ)上通過動物實驗進一步驗證PLGF是否在SCLC穿過血腦屏障過程中發(fā)揮了作用。
　　 方法：
　　 1、RT-qPCR檢測PLGF在不同肺癌細胞中

7、的表達情況
　　 2、利用體外血腦屏障模型，比較六種肺癌細胞穿過HBMEC單層的情況
　　 3、利用RNAi技術(shù)，構(gòu)建以腺病毒為載體的siPLGF表達系統(tǒng)，獲得病毒顆粒
　　 （1）含目的基因（siPLGF）穿梭子（shuttle）的構(gòu)建
　　 ①構(gòu)建雙鏈siPLGF：雙鏈短發(fā)夾oligoDNA退火連接
　　 ②線性化shuttle空載體與雙鏈siPLGF的連接
　　 ③重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、篩

8、選和鑒定
　　 （2）腺病毒的重組
　　 ①線性化載體shuttle（siPLGF）
　　 ②shuttle和pAdEasy腺病毒載體共轉(zhuǎn)化細菌BJ5183
　　 ③重組子的篩選和鑒定
　　 ④重組子（Ad-shuttle-siPLGF）的大量擴增
　　 （3）病毒顆粒的包裝
　　 ①AD293細胞的培養(yǎng)
　　 ②初級病毒顆粒的形成
　　 ③二級病毒顆粒的形成

9、>　　 ④三級病毒顆粒的形成
　　 ⑤病毒顆粒滴度的測定
　　 4、Ad-si-PLGF感染3種SCLC，檢測其穿過HBMEC單層的情況
　　 （1）腺病毒感染3種SCLC
　　 （2）RT-qPCR鑒定PLGF-siRNA干擾效果
　　 （3）檢測感染后的SCLC穿過HBMEC單層的情況
　　 5、體內(nèi)實驗
　　 （1）經(jīng)心室內(nèi)途徑接種肺癌細胞，分析不同肺癌細胞在動物體內(nèi)的成瘤

10、特性
　　 ①接種前細胞的處理
　　 ②分別經(jīng)心室內(nèi)途徑接種6種肺癌細胞
　　 ③觀察腦內(nèi)和肺部的成瘤情況
　　 （2）頸內(nèi)動脈接種腺病毒感染的SCLC
　　 ①腺病毒感染3種SCLC
　　 ②分別經(jīng)頸內(nèi)動脈途徑接種感染SCLC
　　 ③觀察腦內(nèi)和肺部的成瘤情況
　　 結(jié)果：
　　 1、PLGF在不同肺癌細胞中的表達情況
　　 RT-qPCR檢測不同肺癌細胞

11、中PLGF的表達，NCI-H250（來源于小細胞肺癌腦轉(zhuǎn)移灶）和NCI-H209（來源于小細胞肺癌骨髓轉(zhuǎn)移灶）兩株小細胞肺癌細胞PLGF高表達；而NCI-H446（來源于小細胞肺癌胸水滲漏的細胞）則PLGF表達較低。而A549、NCI-H460和NCI-H292低表達PLGF。結(jié)果表明：PLGF可能與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)，而且與腦轉(zhuǎn)移相關(guān)性大。
　　 2、利用體外血腦屏障模型，比較六種肺癌細胞穿過HBMEC單層的情況
　　 利用

12、體外血腦屏障模型，檢測CFSE熒光染色的六種肺癌細胞穿過HBMEC單層的情況，三種小細胞肺癌細胞（NCI-H250、NCI-H209、NCI-H446）穿過數(shù)明顯高于非小細胞肺癌（A549、NCI-H460、NCI-H292）。
　　 3、構(gòu)建以腺病毒為載體的siPLGF表達系統(tǒng)，獲得病毒顆粒
　　 （1）成功構(gòu)建了攜帶短發(fā)夾siPLGF的穿梭載體：shuttle（siPLGF），并與腺病毒骨架載體成功重組，獲得腺病毒R

13、NAi重組子（Ad-shuttle-siPLGF）。
　　 （2）完成AD293細胞三次病毒包裝并獲得了病毒顆粒，含量為1.5×1011viruses。
　　 4、Ad-si-PLGF感染3種小細胞肺癌細胞，檢測其穿過HBMEC單層的情況
　　 （1）腺病毒感染NCI-H250、NCI-H209、NCI-446三種細胞。
　　 （2）RT-qPCR檢測腺病毒感染的3種小細胞肺癌細胞PLGF，Ad-si-P

14、LGF組的PLGF表達明顯少于兩個對照組。
　　 （3）與感染Ad-shuttle-vector和Ad-shuttle-scramble的細胞相比，PLGF沉默的SCLC穿過HBMEC單層的細胞數(shù)明顯減少。
　　 5、體內(nèi)實驗
　　 （1）經(jīng)心室內(nèi)接種6種肺癌細胞，在動物體內(nèi)成瘤性有明顯差異
　　 NCI-H446和NCI-H460細胞成瘤性最好，NCI-H292和A549細胞成瘤性較好，而NCI-H20

15、9和NCI-H250細胞則成瘤性較差。六種肺癌細胞在肺部均可見成瘤，但未發(fā)現(xiàn)一例腦內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤。
　　 （2）頸內(nèi)動脈接種腺病毒感染的SCLC成瘤情況
　　 三種小細胞肺癌細胞具有不同的腦轉(zhuǎn)移能力，NCI-H209的腦內(nèi)成瘤機會更高些，小細胞肺癌細胞腦轉(zhuǎn)移瘤主要發(fā)生在脈絡(luò)叢及腦皮質(zhì)層等血運豐富部位。與對照組相比，PLGF沉默的SCLC無一例發(fā)生肺癌腦轉(zhuǎn)移，PLGF可能參與了SCLC穿過血腦屏障轉(zhuǎn)移入腦這一過程。