紅移藻膽蛋白和光敏色素的研究及分子進化.pdf

1、光作為能量與信息的攜帶者，不僅可以通過光合作用轉(zhuǎn)化為化學能，為生物體提供能量，還可以通過感光受體對生物體的生理過程進行調(diào)節(jié)。藍細菌作為光合作用的模式生物，主要由藻膽體捕獲光能。為了提高光合效率，藍細菌在長期的自然選擇過程中進化出了一套由藍細菌光敏色素識別和響應，從而調(diào)節(jié)藻膽體重構(gòu)的機制。在藻膽體中，有一種核膜連接蛋白(ApcE)，作為藻膽體的能量傳遞終端，特征吸收峰及熒光峰均比其他藻膽蛋白更為紅移，這種特性使得其進化為近紅外熒光探針具有

2、一定的優(yōu)勢。而藍細菌光敏色素(CBCR)可以響應光的變化，這使得其適合發(fā)展成為光控開關探針。
　　在普通的藍細菌中，共價連接藻藍膽素的核膜連接蛋白(ApcE1)最大吸收峰在660 nm，最大熒光峰在675 nm。近期發(fā)現(xiàn)了一類可以利用近紅外光進行光合作用的藍細菌，并在這類藍細菌中發(fā)現(xiàn)了吸收峰大于700 nm，熒光峰大于710nm的組分。Synechococcus sp.PCC7335就屬于這類藍細菌。通過序列比對，在這個藻中找到了

3、一個沒有保守性半胱氨酸的核膜連接蛋白(ApcE2)，可能與紅移的組分有關。為了證實其特征吸收峰及特征熒光峰是否發(fā)生紅移，將其N端結(jié)合色素的結(jié)構(gòu)域(1-273)克隆至表達載體并與產(chǎn)生色素PCB、PEB、PΦB的色素合成酶在大腸桿菌中進行共表達，產(chǎn)生的色素蛋白的最大吸收峰分別在700 nm、615 nm和711 nm，最大熒光峰分別在714nm、628 nm和726 nm，相比較典型的ApcE1，特征峰均紅移了近40 nm。由于雙體的PCB

4、-ApcE2(1-273)與之后經(jīng)過截短的單體PCB-ApcE2(24-245)最大吸收峰均在700 nm，最大熒光峰均在714nm，因此排除了激子耦合而引起光譜紅移的可能性。經(jīng)過酸性尿素變性實驗、蛋白膠的醋酸鋅染色及氯仿萃取實驗，證明了光譜的紅移主要是由于色素與蛋白的非共價連接，進而保留了色素Δ3，31間的雙鍵，使得共軛雙鍵的長度增長導致的。這種不需要裂合酶的催化、非共價的色素化為近紅外熒光團的開發(fā)提供了新的思路。為了驗證ApcE2作

5、為熒光探針的潛力，將色素合成酶的基因與ApcE2構(gòu)建到一個質(zhì)粒上進行標記，在大腸桿菌中得到成功運用。為了進一步將其優(yōu)化成近紅外熒光探針，對ApcE2進行了定點誘變，得到了可以非共價連接膽綠素的誘變體，使最大熒光峰更進一步紅移至730 nm。為了拓展應用范圍，嘗試通過體外添加色素與體內(nèi)合成色素兩種方式提供發(fā)色團，在動物細胞內(nèi)進行表達，雖然沒有檢測到熒光，但這些工作為下一步優(yōu)化研究奠定了基礎。
　　Chr.thermalis PCC7

6、203也是一種可以利用近紅外光進行光合作用的藻，通過序列比對我們發(fā)現(xiàn)了一個別藻藍蛋白ApcF2，其與前面研究的ApcE2類似，也沒有保守半胱氨酸。為了檢測其光譜性質(zhì)是否適合作為近紅外熒光探針，在大腸桿菌中共表達ApcF2和合成色素的酶，產(chǎn)生的色素蛋白PCB-ApcF2最大吸收峰在674 nm，最大熒光峰在700nm，酸性尿素變性實驗證明了色素與蛋白的連接亦是非共價的。為了進一步將其開發(fā)為近紅外熒光探針，對蛋白不保守的N端氨基酸進行了缺失

7、，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙體的ApcF2也可以變?yōu)閱误w，并發(fā)現(xiàn)N端截短的氨基酸在保持蛋白的活性及色素的穩(wěn)定性方面存在重要作用。相比較ApcE2，ApcF2在進化為近紅外熒光探針方面更具優(yōu)勢:ApcF2分子量更小，且蛋白可溶性非常好，在較寬的pH范圍內(nèi)依然保持較高的活性，故運用范圍更廣。在本章實驗中，還對大腸桿菌的膜進行了標記，并運用熒光顯微鏡觀察到了熒光，這為下一步在動物細胞中的標記奠定了基礎。在對ApcF2(20-169)進行隨機誘變的實驗中，我們

8、得到了光譜藍移、熒光量子產(chǎn)率更高的誘變體，這為更進一步進行雙色標記提供了原材料。
　　近年來，將光敏色素作為光受體來構(gòu)建光遺傳學工具的研究越來越多。由于動物組織對可見光的不可透性及紅外線的強烈衰減性，使得對遠紅及近紅外光響應的光受體越來越受重視。本研究中，我們從來源于Synechocystis sp.PCC6803中的藍細菌光敏色素1393gaf3出發(fā)進行分子進化，嘗試尋找到對遠紅及近紅外光響應的誘變體。通過對誘變位點及光譜的分析