中樞注射CCK對大鼠攝食行為以及相關(guān)神經(jīng)元功能的影響.pdf

1、膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)是胃腸激素,主要分泌于十二指腸和空腸,除了在外周發(fā)揮多種調(diào)節(jié)胃腸功能的作用,也見于腦內(nèi),在腦內(nèi)作為神經(jīng)傳遞介質(zhì)發(fā)揮作用,因此,CCK也是一種腦腸肽.1973年,Gibbs實驗室首次發(fā)現(xiàn)大鼠腹腔注射CCK-8導(dǎo)致大鼠攝食量明顯減小,反應(yīng)呈劑量依賴性,外周循環(huán)中CCK抑制食欲的作用已在不同種類的動物和人的研究中證實,外周注射CCK抑制食欲的作用是短暫的,使進食量減少但代償性的進食次數(shù)增多,

2、重復(fù)或長期應(yīng)用CCK并不使體重減輕,CCK對食欲的作用通過CCK-1受體介導(dǎo).然而,腦內(nèi)CCK對攝食的作用及其機理尚不清楚.Blevin.et al曾對大鼠腦內(nèi)多部位直接注射CCK-8,誘導(dǎo)出短時間的攝食抑制,并證明作用部位主要為DMH和Arc.OLETF大鼠(Otsuka Long-Evans Tokushima fatty rats)的CCK-1受體基因先天性缺失,表現(xiàn)為貪食,逐漸轉(zhuǎn)為肥胖,最后出現(xiàn)2型糖尿病,對于OLETF大鼠的研

3、究提示,CCK無論在外周還是在腦內(nèi)的作用均對大鼠攝食控制中起抑制作用,進一步對于OLETF大鼠的研究發(fā)現(xiàn),成年OLETF大鼠DMHNPY(神經(jīng)肽Y)明顯增高,CCK 1受體缺失導(dǎo)致DMH NPY基因表達失調(diào)可能對OLETF大鼠肥胖和糖尿病的形成起作用.隨之,免疫組化顯示大鼠DMH的NPY神經(jīng)元上具有CCK-1受體,提示下丘腦內(nèi)CCK.可能通過CCK-1受體介導(dǎo)作用于DMH的NPY神經(jīng)元起作用,推測"DMH CCK-NPY"信號通路可能參

4、與攝食控制.盡管如此,其確切的機理仍不明. 本研究通過觀察DMH核團內(nèi)注射CCK對大鼠攝食的影響以及時間過程特點,檢測DMH NPY基因、Arc NPY基因、Arc POMC基因和PVN CRF基因表達以及觀察DMH核團內(nèi)注射CCK后丘腦和腦干神經(jīng)元激活的部位,探討DMH注射CCK抑制攝食的特征以及相應(yīng)的神經(jīng)元活動的特征. 方法:以成年Sprague-Dawley雄性大鼠(250～300g)為材料,置于20℃恒溫環(huán)境,1

5、2h∶12h(明:暗)的燈光周期中分籠飼養(yǎng). 1.清醒大鼠攝食實驗:12只大鼠,實驗組n=7,對照組n=6.大鼠麻醉后,按Paxinos-Watson圖譜在下丘腦背內(nèi)側(cè)區(qū) (dorsal medial hypothalamuS,DMH)插入套管,坐標為前囟后3.1 mm,旁開0.4 mm,顱骨表面下8.1mm.一周后大鼠恢復(fù)良好,可進入實驗.大鼠于手術(shù)恢復(fù)期時使其建立飲食規(guī)律:關(guān)燈前2小時禁食,隨之22小時予以常規(guī)顆粒飼料.動物

6、可自由飲水.實驗組DMH核團微量注射 CCK-8 500nmol/0.3ul,對照組DMH核團微量注射人工腦脊液(aCSF)0.3ul,人工腦脊液組成:(147mM Na<'+>,2.7mM K<'+>,1.2mMCa<'++>,0.85mMMg<'++>and 153.8mMCl<'+>),注射于關(guān)燈前實施,注射后立即關(guān)燈,并給予食物,然后分別于注射后 30min、1h、2h、4h、22h記錄進食量.7天后,給予第二次DMH核團注射C

7、CK-8和aCSF,實驗組對照組交叉,注射時間和劑量以及進食量的記錄同第一次. 2.下丘腦NPY,CRF和POMC基因表達分析:攝食實驗后,13只大鼠重新分組,實驗組n=7,對照組n=6.DMH核團內(nèi)注射CCK和aCSF步驟同前,注射后關(guān)燈但繼續(xù)禁食,3小時后斷頭取腦,急速置于-80℃保存,待組織學檢查套管位置和檢測DMH NPY、Arc NPY、Arc POMC和PVN CRF的mRNA表達.大鼠前腦中部作14μm系列冠狀切片

8、貼于玻片上,以4﹪多聚甲醛固定.挑取PVN、DMH、Arc的切片,應(yīng)用RNA原位核酸雜交,分別檢測DMH NPYmRNA、Arc NPY mRNA和POMC mRNA、PVN CRF mRNA的表達.<'35>S-cRNA探針以POMC、NPY和CRF cDNA為模板體外轉(zhuǎn)錄.切片以醋酸酐處理,酒精脫水后加雜交緩沖液(含<'35>S-cRNA 6<'*>10<'8>cpm/μl)55℃過夜,雜交后清洗、脫水、干燥、曝光顯影.放射自顯影圖

9、象以NIH Scion Image軟件進行定量分析. 3.下丘腦和小腦c-FOS表達:28只雄性大鼠檢測DMH注射CCK后下丘腦和小腦與攝食相關(guān)神經(jīng)核中c-FOS細胞.大鼠分二組,每組14只,清醒狀態(tài)下分別注射CCK-8和aCSF,劑量和方法同前.注射后立即禁食,90分鐘后以戊巴比妥麻醉后,經(jīng)心臟以PBS和4﹪多聚甲醛灌流,然后取腦置于4﹪多聚甲醛/25﹪蔗糖溶液中浸泡,4℃保存1-2天,在前腦中部和后腦作40μm系列冠狀切片,

10、包括下列部位:室旁核(paraventrical nucleus PVN)、視上核(supraoptic nucleus SON)、視交叉上suprachiasmatic neucleus SCh)、后交叉區(qū)retrochiasmatic area(RCh)、外側(cè)下丘腦(lateral hypothalamus LH)、丘腦背內(nèi)側(cè)核(dorsomedial hypothalamic hypothalamic nucleus DMH)、丘

11、腦腹內(nèi)側(cè)核(ventromedial hypothalamic nucleus VMH)、弓狀核(arcuate nucleusArc)、后腦杏仁核 (amygadMa nucleus,CeA)、最后區(qū)(areapostrema AP)、孤束核(nucleus ofthe solitary tract NTS).c-FOS以免疫組織化學法檢測,采用漂浮法,0.3﹪過氧化氫1h,羊血清包被1h,1:10,000兔c-FOS抗體(Oncog

12、ene Science,SanDiego,CA)孵化過夜,生物素.羊抗兔血清lh,ABC復(fù)合試劑(Elite Vectastain Kit.Vector Labs,Burlingame,CA)lh,以二氨基聯(lián)苯(DAB)顯色.終止反應(yīng)后,將組織切片貼到玻片上,干燥,酒精脫水后,顯微鏡下觀察切片內(nèi)套管軌跡和c-FOS表達,套管位置不正確者棄去.c-FOS陽性細胞定量以自動圖象分析軟件處理(IpLab,ScanalytiCS,Faiffax

13、,VA),除DMH分別計數(shù)注射側(cè)和注射對側(cè),其余部位均計數(shù)腦二側(cè),在每個部位均讀取2～3張切片,取平均值,神經(jīng)解剖學定位參照Paxinos.Watson圖譜. 4.統(tǒng)計學檢驗:結(jié)果采用均數(shù)士標準誤,均數(shù)t檢驗統(tǒng)計學處理,P<0.05說明有統(tǒng)計學意義. 結(jié)論 DMH CCK具有攝食抑制作用,與外周CCK作用短暫不同,DMH CCK作用持續(xù)時間較長;DMH CCK作用于NPY神經(jīng)元抑制NPY基因表達而發(fā)揮攝食抑制的