腫瘤壞死因子α對小鼠心房肌細(xì)胞Hl-1電重構(gòu)影響機制.pdf

1、隨著人口老齡化及平均壽命延長，心房顫動(Atrial Fibrillation，AF)的發(fā)病率越來越高，其對人群死亡率、致殘率的影響非常顯著。預(yù)計2020年我國人口將達(dá)到14.5億，60歲以上老年人約占人口總數(shù)20％，醫(yī)務(wù)工作者面臨艱巨的房顫預(yù)防和治療工作。近年心房顫動研究進(jìn)展迅速，藥物治療和導(dǎo)管射頻消融術(shù)取得了一定進(jìn)步，但許多患者治療效果不佳，因此必須進(jìn)一步深入研究其發(fā)病機制，尋求新的治療途徑。
　　 房顫的始動因素很多，隨著

2、房顫持續(xù)時間延長，心房電生理和細(xì)胞特性發(fā)生改變使房顫得以持續(xù)，這一過程稱為電重構(gòu)，主要特點包括動作電位時限(APD)和心房有效不應(yīng)期(ERP)縮短及離散度增加，頻率適應(yīng)性降低，心房傳導(dǎo)速度減慢使心房波長縮，使房顫易于誘發(fā)及穩(wěn)定性增加。而心房不應(yīng)期和動作電位的縮短，與內(nèi)向離子流（Ca2+或Na+）凈減少，外向離子流(K+)凈增加，縫隙連接減少密切相關(guān)。
　　 心房電重構(gòu)發(fā)生的基礎(chǔ)就是離子通道的損傷或者功能改變，其機制復(fù)雜，早期研究

3、認(rèn)為心鈉素、心房肌缺血與ATP敏感性鉀通道、自主神經(jīng)系統(tǒng)、鈣超載和代謝紊亂可能是房顫電重構(gòu)的觸點，近年來人們將注意力集中于氧化應(yīng)激和損傷的途徑上。多項研究證實AF患者右心耳組織、血漿中的高敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-6（IL-6）較竇性心律組明顯升高，TNF-α血清濃度在陣發(fā)性、持續(xù)性和永久性房顫中呈進(jìn)行性遞增，認(rèn)為氧化應(yīng)激和炎癥可直接導(dǎo)致房顫的病理生理改變。動物實驗發(fā)現(xiàn)TNF-α可影響到大鼠心室肌

4、L型鈣電流、CX40，對其它離子通道及縫隙鏈接作用不明確。
　　 炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-4參與激活和調(diào)節(jié)JAK-STAT信號通路，JAK-STAT信號通路可上調(diào)環(huán)氧化酶（COX-2）、一氧化氮合酶(NOS2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、抗氧化劑錳超氧化物歧化酶(MnSOD)、金屬硫蛋白(MT1 and MT2)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)等，從而影響心肌肥厚和心肌重構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)藜蘆醇通過阻斷JAK/STAT1通路

5、從而達(dá)到控制干擾素介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷徙，能降低炎癥反應(yīng)對血管的損害，降低動脈血栓和斑塊的形成。在STAT3基因敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)心臟間質(zhì)纖維化增加，TNF-α分泌增多，心肌擴張和心功能受損;敲除STAT3基因或者使用JAK2抑制劑AG490降低STAT3表達(dá)，可使心肌梗死面積增大;Adawi研究發(fā)現(xiàn)大鼠心肌梗死模型中，予AG490后Kv4.3mRNA表達(dá)增加，可見JAK-STAT信號通路是參與了多種心血管疾病的病理生理。
　　 本研究

6、通過觀察TNF-α慢性刺激HL-1細(xì)胞，探討TNF-α對部分離子通道及縫隙連接的影響， JAK-STAT信號通路在炎癥因子TNF-α作用下，參與調(diào)節(jié)電重構(gòu)的機制。本實驗分兩部分。
　　 第一部分TNF-α對HL-1心房肌細(xì)胞電重構(gòu)的影響
　　 目的:TNF-(α參與冠心病、心力衰竭、風(fēng)濕性心臟病、先天性心臟病的多種心血管疾病病理過程，但在房顫發(fā)病機制中的作用尚不清楚。本部分實驗通過不同濃度TNF-α刺激HL-1細(xì)胞后，通

7、過檢測電重構(gòu)相關(guān)的基因，探討TNF-(α對HL-1細(xì)胞電重構(gòu)的影響。
　　 方法:TNF-α25ng/ml、50ng/ml刺激HL-1細(xì)胞24小時后，提取總RNA和總蛋白，使用Real-time PCR(RT-PCR)檢測CACNA1c、KCNJ2、KCNH2、KCNQ1、GJA5、GJA1、SLC8A1的mRNA表達(dá)，用蛋白印跡泫(Western bloting)測定CAV1.2和ERG的表達(dá)，并用膜片鉗方法記錄對照組和實驗組

8、Ica，L、IKR電流和APD。采用pCLAMP10.2軟件對單個全細(xì)胞記錄進(jìn)行數(shù)據(jù)和圖形轉(zhuǎn)換，Prism3.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合及繪制離子通道電流密度及APD，電流密度(pA/pF)=電流強度/電容。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，mRNA比較采用one-way ANOVA方法檢驗，采用LSD方法進(jìn)行兩兩比較。IcaL、Ikr、APD采用兩獨立樣本t檢驗。用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

9、
　　 結(jié)果:RT-PCR發(fā)現(xiàn)1.CACNA1c mRNA水平隨著TNF-α濃度的增加而減少，對照組與實驗組TNF-α25ng/ml、TNF-α50ng/ml有顯著差異分別為(p=0.009，p=0.000)，而實驗組TNF-α50ng/ml組更低于25ng/ml(p=0.005)。2.KCNJ2 mRNA水平隨著TNF-α濃度的增加而增加，但對照組與25ng/ml組無明顯差別(p=0.381)，與50ng/ml有顯著差異(P=

10、0.023)，實驗組之間無顯著差別(p=0.082)。3.KCNH2 mRNA實驗組25ng/ml、50ng/ml顯著高于對照組(p=0.031，p=0.012)，但實驗組之間無顯著差別(P=0.464)。4.KCNQ1 mRNA實驗組25ng/ml、50ng/ml與對照組無顯著差異(p=0.598，p=0.775)，實驗組之間無顯著差異(p=0.806)。5.GJA5 mRNA25ng/ml、50ng/ml與對照組無顯著差異(p=0.

11、262，p=0.404)，實驗組之間無顯著差異(p=0.077)。6.GJA1 mRNA水平隨著TNF-α濃度的增加而增加，但對照組與25ng/ml組無明顯差別(p=0.145)，對照組、25ng/ml組與50ng/ml有顯著差異分別為(p=0.001，p=0.003)。7.SLC8A1 mRNA水平隨著TNF-α濃度的增加而增加，對照組與25ng/ml組、50ng/ml組有顯著差異分別為(p=0.027和p=0.009)，實驗組25n

12、g/ml組與50ng/ml之間無顯著差異(p=0.396)。
　　 蛋白印跡法發(fā)現(xiàn)鈣離子通道CAV1.2隨著TNF-α濃度增加而減少，鉀離子通道ERG隨著TNF-α增加而增加。
　　 通過膜片鉗檢測發(fā)現(xiàn)與對照組相比，TNF-α組L型鈣通道離子電流密度減少，電流密度在指令電位指令電位-10mv、0 mv、10mv、20mv、30mv、40mv明顯下降有顯著差異分別為(p=0.001，p=0.000，p=0.000，p=0.

13、002，p=0.003，p=0.040)。與對照組相比，TNF-α組快速激活延遲整流鉀電流平臺期電流密度增加，平臺期電流密度在指令電位-40、-30、-20、-10、30、40、50mv有顯著差異(p=0.001, p=0.016, p=0.033, p=0.038, p=0.000, p=0.000, p=0.000), TNF-α組30、40、50mv時是對照組1.52、1.84、1.81倍。與對照組相比，TNF-α組快速激活延遲整

14、流鉀電流尾電流密度增加，電流密度在指令電位-40、-30、-20、10、20、30、40、50mv有顯著差異分別為(p=0.000，p=0.024，p=0.022，p=0.000，p=0.000，p=0.032，p=0.011，p=0.039)，TNF-α組30、40、50mv時是對照組1.24、1.308、1.289倍。與對照組相比，TNF-α組APD50縮短43.6％(p=0.003)，APD90縮短40％(p=0.000)，APD

15、50-APD90縮短37.9％(p=0.003)。
　　 結(jié)論:TNF-α可減少L-1細(xì)胞的CACNA1c的mRNA表達(dá)，增加KCNJ2、KCNH2、GJA1、SLCSA1的mRNA表達(dá)，減少CAV1.2和增加ERG蛋白表達(dá)，減少L型鈣通道離子電流、增加快速激活延遲整流鉀電流電流和縮短APD，TNF-α對心房肌細(xì)胞的電重構(gòu)中有重要作用。
　　 第二部分Jak-Stat信號通路對ERG的作用
　　 目的:Jak-S

16、tat信號通路是細(xì)胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程，在心臟發(fā)育、心肌肥厚和心肌纖維化發(fā)揮重要作用。TNF-α通過TNFR2激活Jak-Stat信號通路，在房顫電重構(gòu)的作用尚不清楚。本部分研究初步探討TNF-α刺激HL-1心房肌細(xì)胞后，Jak-Stat信號通路會對其電重構(gòu)是否產(chǎn)生影響。
　　 方法:不同濃度TNF-α刺激HL-1細(xì)胞24小時后，用蛋白印跡法檢測JAK1、STAT

17、3表達(dá)， siRNA敲除STAT3，用蛋白印跡法檢測STAT3和ERG水平，同時用膜片鉗方法觀察對照組和實驗組(siRNA-STAT3) IKR電流和APD。所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示， Ikr、APD采用兩獨立樣本t檢驗。用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，以P≤0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:蛋白印跡法發(fā)現(xiàn)TNF-α0ng/ml、25ng/ml、50ng/ml，慢性刺激24小時后，JAK1和STAT3表達(dá)

18、增多。予siRNA48小時，加入TNF-α24小時后，siRNA-negative組的STAT3和ERG明顯高于siRNA-S TAT3-1組、siRNA-STAT3-2組、siRNA-STAT3-3組、siRNA-STAT3-pool組，STAT3和ERG表達(dá)減少。
　　 膜片鉗觀察發(fā)現(xiàn)與對照組相比，siRNA組快速激活延遲整流鉀電流平臺期電流密度減少，平臺期電流密度在指令電位-30、30、40、50mv有顯著差異(p=0.0

19、66，p=0.007，p=0.000，p=0.000)，30、40、50mv時分別減少35％、49.4％、52％。siRNA組快速激活延遲整流鉀電流尾電流電流密度在指令電位-30、-20、-10、10、20、30、40、50mv明顯減少(p=0.023， p=0.032，p=0.018，p=0.035，p=0.004, p=0.000, p=0.000, p=0.003),30、40、50 mv時減少53.8％、65.8％、70.4％。

20、與對照組相比，siRNA組APD50延長69％(p=0.005)，APD90延長60％(P=0.004)，APD50-APD90延長57.1％(p=0.017)。我們通過t檢驗，發(fā)現(xiàn)siRNA組平臺期電流密度、尾電流電流密度與正常HL-1細(xì)胞相比明顯下降，APD50縮短14％(p=0.283)，APD90縮短9.8％(p=0.339)，APD50-APD90延長6.9％(p=0.555)。
　　 結(jié)論:TNF-α可使HL-1細(xì)胞