青蒿素對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435和T-47D輻射敏感性的影響及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：放射治療是治療惡性腫瘤的一個重要手段，但是在放療過程中，電離輻射在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時，也會引起正常組織和細(xì)胞的損傷。為了提高腫瘤放療療效和降低射線對正常組織器官的損傷而開展了腫瘤輻射增敏作用的研究。腫瘤細(xì)胞p53基因的狀態(tài)與其放射敏感性的關(guān)系最為密切，本課題通過比較青蒿素(Artemisinin)對p53突變型人乳腺癌MDA-MB-435細(xì)胞和p53野生型人乳腺癌細(xì)胞T-47D細(xì)胞這兩種不同p53類型細(xì)胞的輻射增敏作用的差異，來研

2、究青蒿素對p53突變腫瘤細(xì)胞MDA-MB-435的放射增敏作用的機(jī)制。 方法：選擇人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435和T-47D作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。(1)利用MTT法研究青蒿素對MDA-MB-435和T-47D細(xì)胞的存活率的影響，來確定實(shí)驗(yàn)所需青蒿素濃度和作用時間；(2)Annexin V/PI雙染法檢測青蒿素對于經(jīng)60Coy射線輻射誘導(dǎo)的MDA-MB-435和T-47D的細(xì)胞凋亡水平的影響；(3)胞質(zhì)分裂阻滯微核法(cytokines

3、isblock method，CB法)和常規(guī)染色體檢驗(yàn)研究青蒿素和60Coy射線聯(lián)用對MDA-MB-435細(xì)胞微核率，微核細(xì)胞率和染色體畸變的影響；(4)用流式細(xì)胞儀檢測MDA-MB-435和T-47D的細(xì)胞周期分布的改變；(5)Western blot法分析MDA-MB-435和T-47D細(xì)胞的周期蛋白cyclin Bl表達(dá)水平的變化。 結(jié)果：(1) MTT檢測分析顯示：青蒿素對兩種實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的存活率均隨著藥物濃度的增加而減少；

4、實(shí)驗(yàn)確定了青蒿素作用濃度：MDA-MB-435為250μmol/L，T-47D為200μmol/L；作用時間為24h，在這個濃度和時間點(diǎn)下，青蒿素對細(xì)胞毒性較??；(2) Annexin V/PI雙染法凋亡檢測顯示：青蒿素對未經(jīng)照射的MDA-MB-435和T-47D細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率無顯著影響；青蒿素處理后的細(xì)胞，經(jīng)5Gy照射后p53缺陷的MDA-MB-435細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率與單純照射的對照組細(xì)胞比較有顯著差異(P<0.05)，經(jīng)SGy照射

5、對照組的細(xì)胞凋亡率為11.573±1.832％，而青蒿素處理過的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率為32.833±10.105％。但是，經(jīng)青蒿素處理p53野生型T-47D細(xì)胞，5Gy照射后細(xì)胞凋亡率與單純照射的T-47D細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率無顯著差異(p>0.05)，單純照射的細(xì)胞凋亡率為46.393±3.871％，而青蒿素處理后細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率為46.617±11.859％；(3)微核和染色體分析顯示：MDA-MB-435細(xì)胞經(jīng)0、2、4、6Gy照射，相同

6、輻射劑量下預(yù)先經(jīng)青蒿素處理的細(xì)胞的微核率(MNF)、微核細(xì)胞率(MNCF)以及染色體畸變率(dic+r)較單純照射的細(xì)胞均顯著增加(p<0.05)；(4)流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期結(jié)果顯示：在0、5、10Gy照射劑量點(diǎn)，預(yù)先經(jīng)青蒿素處理的MDA-MB-435細(xì)胞G2期細(xì)胞含量相較單純照射的細(xì)胞明顯下降(p<0.05)，并且細(xì)胞受照劑量越大G2期細(xì)胞含量的變化幅度也增大；而青蒿素對T-47D細(xì)胞的G2期細(xì)胞含量改變無顯著影響(p>0.05)；

7、(5)Westem blot分析證實(shí)經(jīng)青蒿素作用，照射后MDA-MB-435細(xì)胞G2期蛋白cyclinB1的表達(dá)水平明顯下調(diào)，但對T-47D細(xì)胞cyclinB1蛋白表達(dá)水平的影響不明顯。 結(jié)論：青蒿素能增加p53突變的乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435輻射后引起的細(xì)胞凋亡率，微核率微核細(xì)胞率以及染色體畸變率，因此證實(shí)青蒿素對MDA-MB-435細(xì)胞有放射增敏作用。然而青蒿素不能改變p53野生型的T-47D細(xì)胞經(jīng)輻射引起的細(xì)胞凋亡水平

8、。青蒿素作用后能改變MDA-MB-435經(jīng)輻射引起的細(xì)胞周期分布情況，比起單純照射的細(xì)胞，青蒿素處理后G2期細(xì)胞含量顯著降低，而T-47D細(xì)胞經(jīng)青蒿素作用的細(xì)胞與單純照射的比較G2期含量無明顯改變；青蒿素可以降低MDA-MB-435細(xì)胞輻射后cyclin Bl蛋白表達(dá)水平，而不能改變T-47D細(xì)胞的cyclin B1表達(dá)水平，由此可以推測青蒿素能通過抑制G2期周期蛋白cycling B1的表達(dá)水平和抑制G2期細(xì)胞阻滯來實(shí)現(xiàn)對p53突變的