59種藥用植物內(nèi)生菌的分離、鑒定及PQQ產(chǎn)生菌的篩選.pdf

1、植物內(nèi)生菌是一類具有豐富物種多樣性的微生物類群，是植物微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。大多數(shù)植物內(nèi)生菌對植物本身有益，能產(chǎn)生在微生物與宿主關(guān)系中發(fā)揮作用的生物活性物質(zhì)。研究表明某些抗癌藥用植物中個別內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的生理活性成分，內(nèi)生菌已經(jīng)成為新的抗菌、抗癌、抗植物病蟲害物質(zhì)的資源寶庫。因此，從大量未研究過的植物中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生微生物新物種和新的活性物質(zhì)的機率較高，植物內(nèi)生菌的研究具有重大意義和潛在的應(yīng)用價值。
　　本研究以59

2、種藥用植物為研究材料，采用植物勻漿法和組織塊法，以NA瓊脂、PDA瓊脂和R2A瓊脂三種培養(yǎng)基分離得到740株內(nèi)生菌純培養(yǎng)物。其中放線菌110株、細菌430株和真菌200株，并對分離所獲得的菌株進行編號和菌種保藏。
　　利用鏈霉菌屬（Streptomyces）、擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）、假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）、糖絲菌屬（Saccharothrix）、小單孢菌屬（Micromonospora）、

3、高溫單孢菌科（Thermomonosporaceae）、鏈孢囊菌科（Streptosporangiaceae）和小單孢菌科（Micromonosporaceae）8種不同類群的放線菌特異性引物，對分離得到的110株放線菌進行快速檢測，95株放線菌被快速鑒定。其中81株菌歸屬于鏈霉菌屬（Streptomyces）、6株菌歸屬于小單孢菌屬（Micromonospora）、4株菌歸屬于擬無枝酸菌屬（Amycolatopsis）、3株菌歸屬于假

4、諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）和1株菌歸屬于糖絲菌屬（Saccharothrix）。未被鑒定的15株內(nèi)生放線菌采用16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果7株菌歸屬于鏈霉菌屬（Streptomyces）、2株菌歸屬于小單孢菌屬（Micromonospora）、2株菌歸屬于諾卡氏菌屬（Nocardia）、1株菌歸屬于假諾卡氏菌屬（Pseudonocardia）、1株菌歸屬于糖絲菌屬（Saccharothrix）、1株菌歸屬于塚村氏菌

5、屬（Tsukamurella）和1株菌歸屬于類諾卡氏菌屬（Nocardioides）。
　　430株植物內(nèi)生細菌采用革蘭氏染色法進行觀察，結(jié)果顯示129株為革蘭氏陰性細菌，301株為革蘭氏陽性細菌。其中43株革蘭氏陰性細菌采用16S rDNA序列系統(tǒng)育分析，將其歸入3個綱，6個目，12個科，16個屬。其中9株菌歸屬于無色小桿菌屬（Achromobacter）、5株菌歸屬于土壤桿菌屬（Agrobacterium）、5株菌歸屬于假單胞

6、菌屬（Pseudomonas）、5株菌歸屬于蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）、4株菌歸屬于草螺菌屬（Herbaspirillum）、3株菌歸屬于根瘤菌屬（Rhizobium）、3株菌歸屬于產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）、1株菌歸屬于納西桿菌屬（Naxibacter）、1株菌歸屬于貪噬菌屬（Variovorax）、1株菌歸屬于污水桿菌屬（Defluvibacter）、1株菌歸屬于屈曲桿菌屬（Ancylobacter）、1株菌歸屬

7、于甲基桿菌屬（Methylobacterium）、1株菌歸屬于劍菌屬（Ensifer）、1株菌歸屬于副球菌屬（Paracoccus）、1株菌歸屬于腸桿菌屬（Enterobacter）和1株菌歸屬于黃單胞菌屬（Xanthomonas）。
　　從430株植物內(nèi)生細菌中篩選出甲醇利用型吡咯喹啉醌產(chǎn)生菌4株。菌株編號分別為：27-083114、27-091417、27-091421和27-083129。通過色譜峰面積定量分析，其PQQ產(chǎn)量

8、分別為：64.34 mg/L、4.61 mg/L、2.92 mg/L和1.97 mg/L。對4株P(guān)QQ產(chǎn)生菌進行16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析將其歸屬于4個屬，分別是芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、蒼白桿菌屬（Ochrobactrum）和無色小桿菌屬（Achromobacter）。
　　本研究篩選到的可產(chǎn)生64.34 mg/L PQQ的野生型菌株27-083114，與革蘭氏陽性細菌酸快生芽孢