人羊膜細(xì)胞的原代培養(yǎng)和在Ⅰ型膠原蛋白支架上的三維培養(yǎng)用于修復(fù)胎膜破口的研究.pdf

1、目的：建立人羊膜上皮細(xì)胞和羊膜間質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)和細(xì)胞純化的方法；選擇促進(jìn)人羊膜細(xì)胞增殖的最佳培養(yǎng)基；構(gòu)建人羊膜細(xì)胞/I型膠原蛋白支架復(fù)合物以用于修復(fù)胎膜破口的研究。 方法：1.通過(guò)酶消化法對(duì)羊膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分離和純化。應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)方法對(duì)人羊膜上皮細(xì)胞和羊膜間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定。 2.利用分光光度劑測(cè)定人羊膜細(xì)胞在4種不同的培養(yǎng)基下的細(xì)胞增殖狀況。Ⅰ組：DMEM/F12+10％FBS+50.0ng/mlEG

2、F+2.5ug/ml胰島素+5ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白+0.1ng/ml T3；Ⅱ組：DMEM/F12+10％FBS；Ⅲ組：DMEM/F12+50.0ng/mlEGF+2.5ug/ml胰島素+5ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白+0.1ng/ml T3；Ⅳ組：DMEM/F12+50.0ng/mlEGF。 3.將羊膜間質(zhì)細(xì)胞嵌入三維基質(zhì)中，羊膜上皮細(xì)胞接種在基質(zhì)的表面，構(gòu)建人羊膜細(xì)胞/Ⅰ型膠原蛋白支架復(fù)合物以模擬人體羊膜組織結(jié)構(gòu)。 4.DAPI

3、標(biāo)記三維基質(zhì)中的細(xì)胞核以計(jì)數(shù)人羊膜細(xì)胞在三維培養(yǎng)第2，8天的細(xì)胞數(shù)量。耦合羅丹明的鬼筆環(huán)肽染色標(biāo)記可特異性地顯示細(xì)胞骨架中的微絲(F-actin)結(jié)構(gòu)以觀察細(xì)胞在三維基質(zhì)中的細(xì)胞形態(tài)。掃描電鏡和透射電鏡觀察羊膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞在三維培養(yǎng)中的超微結(jié)構(gòu)。 5.培養(yǎng)含有不同數(shù)量羊膜間質(zhì)細(xì)胞的人羊膜細(xì)細(xì)胞/Ⅰ型膠原蛋白支架復(fù)合物，15 d后檢測(cè)抗張強(qiáng)度。 結(jié)果： 1.采用胰蛋白酶和膠原酶先后消化的方法可以將羊膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)

4、胞進(jìn)行細(xì)胞分離培養(yǎng)。人羊膜細(xì)胞體外培養(yǎng)表現(xiàn)出良好的細(xì)胞增殖能力和傳代能力。2.羊膜間質(zhì)細(xì)胞在缺少胎牛血清的培養(yǎng)基里缺乏增殖能力。人羊膜細(xì)胞在含有胎牛血清、表皮生長(zhǎng)因子、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白及三碘甲腺原氨酸的培養(yǎng)基里表現(xiàn)出較其余3組更強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力(P＜0.001)。(羊膜上皮細(xì)胞Ⅰ組：1.130±0.203：Ⅱ組：0.487±0.141；Ⅲ組：0.466±0.094；Ⅳ組：0.451±0.144。羊膜間質(zhì)細(xì)胞Ⅰ組：1.356±0.173：

5、Ⅱ組：0.930±0.112；Ⅲ組：0.200±0.053；Ⅳ組：0.190±0.029)。3.人羊膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞在Ⅰ型膠原蛋白基質(zhì)中的培養(yǎng)顯示出與體內(nèi)人羊膜細(xì)胞的相似性，人羊膜細(xì)胞在三維培養(yǎng)的過(guò)程中細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯增加，人羊膜間質(zhì)細(xì)胞可導(dǎo)致I型膠原蛋白的收縮，抑肽酶和GM6001也不能抑制這種收縮。4.人羊膜細(xì)胞/Ⅰ型膠原蛋白復(fù)合物抗張強(qiáng)度隨人羊膜間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的增多而增強(qiáng)(P＜0.001)。 結(jié)論： 1.羊膜上皮細(xì)胞和間質(zhì)