MicroRNA-34a與Notch 1在肝細(xì)胞肝癌中表達(dá)及侵襲、轉(zhuǎn)移中作用的研究.pdf

1、肝細(xì)胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)簡(jiǎn)稱肝癌,是世界范圍內(nèi)最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,惡性程度極高,發(fā)病存在逐年增高的趨勢(shì)。我國(guó)是HCC高發(fā)國(guó)家,肝癌死亡率處于惡性腫瘤的第2位。究其原因,主要與HCC的早期診斷方法、結(jié)果敏感性的局限,及HCC細(xì)胞在發(fā)展過程中易發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移等等多種復(fù)雜因素相關(guān)。所以,目前許多研究熱點(diǎn)關(guān)注于在分子或基因水平上的肝癌早期診斷,及如何針對(duì)其侵襲、轉(zhuǎn)移進(jìn)行相應(yīng)治療。
　　

2、隨著對(duì)HCC發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制的深入研究,一類微小RNA(microRNAs,或miRNAs)被引入視線。miRNAs是參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的非編碼小RNAs,以干擾mRNA翻譯的形式調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí),已有的大量研究也證實(shí)了miRNAs與腫瘤的關(guān)系密切。其中,更有研究表明mir-34a與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是密切相關(guān)的。
　　Notch信號(hào)通路廣泛存在于多種生物體組織細(xì)胞中,是一種在進(jìn)化過程中十分保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),可調(diào)控

3、并影響細(xì)胞分化、增殖、發(fā)育及凋亡等生物學(xué)行為。近幾年的大量研究顯示:notch1在多種腫瘤中異常表達(dá),它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程也密切相關(guān)。有研究表明notch信號(hào)通路在HCC的發(fā)生、發(fā)展過程中也起到了重要的作用。
　　已有部分研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)在一些腫瘤中,mir-34a能夠抑制notch1發(fā)揮抑癌作用。迄今為止,關(guān)于HCC中兩者之間的關(guān)系國(guó)內(nèi)、外暫時(shí)尚未見諸報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)小組旨在通過對(duì)mir-34a與notch1在HCC組織、癌旁正常組

4、織、正常肝組織、HCC細(xì)胞系與非腫瘤肝細(xì)胞中表達(dá)的差異和相互作用進(jìn)行研究,探討兩者在HCC中的相互關(guān)系,為HCC侵襲、轉(zhuǎn)移的研究和臨床診斷、治療及預(yù)后判斷提供依據(jù),奠定相應(yīng)基礎(chǔ)。
　　目的:
　　本實(shí)驗(yàn)擬通過觀察mir-34a、notch1在HCC組織、癌旁正常組織、正常肝組織、不同侵襲能力肝臟腫瘤細(xì)胞系和非腫瘤肝臟細(xì)胞系中表達(dá)的差異及調(diào)控后的變化情況,研究并探討二者與HCC臨床病理特征的關(guān)系,及在HCC細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力方

5、面的作用及趨勢(shì)。
　　方法:
　　應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(qRT-PCR)和免疫組織化學(xué)染色法(SP法)檢測(cè)mir-34a、notch1在132例HCC組織及癌旁組織、49例正常肝臟組織中的表達(dá)情況。應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究上述組織中mir-34a、notch1受體表達(dá)與HCC臨床病理特征的關(guān)系。將分組后的患者進(jìn)行Kaplan-Meier分析以比較各組的生存時(shí)間;將臨床病理指標(biāo)納入多元逐步COX風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析,觀察mir-

6、34a、notch1及其相關(guān)臨床病理特征與HCC患者生存時(shí)間的關(guān)系。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)不同侵襲能力的肝臟腫瘤細(xì)胞系(HepG2,Huh-7,SMCC-7721,MHCC97)和非腫瘤肝臟細(xì)胞系(HL-7702)中mir-34a的表達(dá)情況;Western Bloting方法檢測(cè)細(xì)胞系中notch1的表達(dá)情況。
　　通過特異性的microRNA mimics和microRNA inhibitors采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法分

7、別作用于選定的肝臟腫瘤細(xì)胞系MHCC97-H、HepG2,以上調(diào)或抑制mir-34a的表達(dá),采用Western Bloting方法檢測(cè)2種肝臟腫瘤細(xì)胞系中notch1的表達(dá)變化情況。
　　應(yīng)用特異性的microRNA mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝臟腫瘤細(xì)胞系MHCC97-H以上調(diào)mir-34a的表達(dá);microRNA inhibitors瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝臟腫瘤細(xì)胞系HepG2以抑制mir-34a的表達(dá),在體外采用transwell小室基質(zhì)侵襲

8、、遷移實(shí)驗(yàn),觀察這兩種肝臟腫瘤細(xì)胞系侵襲、遷移能力的變化情況。
　　結(jié)果:
　　qRT-PCR檢測(cè)顯示132例HCC組織中mir-34a表達(dá)水平明顯低于癌旁及正常肝臟組織,且轉(zhuǎn)移灶癌組織比HCC組織低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　qRT-PCR檢測(cè)顯示132例HCC組織中notch1表達(dá)水平明顯高于癌旁及正常肝臟組織,且轉(zhuǎn)移灶癌組織比HCC組織高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。免疫組織化學(xué)染色顯示not

9、ch1受體陽性染色主要位于細(xì)胞膜,呈現(xiàn)棕色及棕黃色顆粒樣,細(xì)胞漿中亦有少量表達(dá)。在HCC組織中,26例(19.70％)陰性表達(dá),34例(25.76%)弱陽性表達(dá),37例(28.02%)中等陽性表達(dá),35例(26.52%)強(qiáng)陽性表達(dá)。Notch1受體在HCC組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織及正常肝臟組織,表達(dá)水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在癌旁組織及正常肝組織中,notch1受體僅有少部分顯示為弱陽性染色,其余為陰性。將north1評(píng)

10、分值5分作為分界值將患者分成兩組,分析發(fā)現(xiàn)mir-34a與north1在HCC及癌旁組織中均成負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.259(P=0.003)、-0.274(P=0.002)。
　　mir-34a、notch1在HCC組織中的表達(dá)均與患者的腫瘤惡性程度、腫瘤個(gè)數(shù)、腫瘤體積、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)(P<0.05);而與患者的年齡、性別、肝功能、腫瘤部位、是否合并肝硬變、是否伴隨肝炎病毒感染及AFP含量等因素?zé)o相關(guān)性(P>0.

11、05)。
　　依據(jù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)目的和要求,選取表現(xiàn)典型的mir-34a低表達(dá)、notch1高表達(dá)組患者,及mir-34a高表達(dá)、notch1低表達(dá)組患者作為研究對(duì)象,進(jìn)行Kaplan-Meier分析示:mir-34a低表達(dá)、notch1高表達(dá)組患者術(shù)后三年生存率(11.3%),明顯低于mir-34a高表達(dá)、notch1低表達(dá)組(34.7%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=38.163,P=0.011)。上述臨床病理指標(biāo)納入多元逐步COX

12、風(fēng)險(xiǎn)比例回歸模型分析,結(jié)果表明:較大的腫瘤體積、多發(fā)的腫瘤、較低的腫瘤分化程度、出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、有靜脈浸潤(rùn)、有門靜脈癌栓、有衛(wèi)星灶損害、較高的TNM分期、mir-34a低表達(dá)及notch1高表達(dá)是影響患者生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素;而本次實(shí)驗(yàn)采集的其他臨床病理因素與患者生存時(shí)間無明顯相關(guān)性。
　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)不同侵襲能力的肝臟腫瘤細(xì)胞系后顯示:4種肝臟腫瘤細(xì)胞系(HepG2,Huh-7,SMCC-7721,MHCC97)中m

13、ir-34a表達(dá)明顯低于非腫瘤肝臟細(xì)胞系(HL-7702),其中MHCC97表達(dá)最低,HepG2表達(dá)最高,依據(jù)實(shí)驗(yàn)的最初設(shè)計(jì)目的和要求,選定該2種肝臟腫瘤細(xì)胞系為進(jìn)一步研究對(duì)象,進(jìn)而繼續(xù)以Western Bloting方法檢測(cè)此2種肝臟腫瘤細(xì)胞系中notch1的表達(dá)顯著高于非腫瘤肝臟細(xì)胞系(HL-7702)。
　　在選定的肝臟腫瘤細(xì)胞系MHCC97-H中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染特異性的microRNA mimics以上調(diào)mir-34a的表達(dá)后,應(yīng)

14、用Western Bloting方法檢測(cè)此腫瘤細(xì)胞系中notch1的表達(dá)較調(diào)控前明顯較弱;在選定的肝臟腫瘤細(xì)胞系HepG2中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染特異性的microRNA inhibitors以抑制mir-34a的表達(dá)后,應(yīng)用Western Bloting檢測(cè)顯示細(xì)胞系中notch1的表達(dá)較調(diào)控前明顯增強(qiáng)。
　　應(yīng)用特異性的microRNA mimics瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝臟腫瘤細(xì)胞系MHCC97-H以上調(diào)mir-34a的表達(dá),在體外應(yīng)用transwel

15、l小室侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:該細(xì)胞系穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)目明顯減少。使用microRNA inhibitors瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝臟腫瘤細(xì)胞系HepG2以抑制mir-34a的表達(dá)后,在體外應(yīng)用transwell小室侵襲、遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:該細(xì)胞系穿透小室膜的細(xì)胞數(shù)目明顯增多。
　　結(jié)論:
　　mir-34a在HCC組織(或細(xì)胞)中較正常肝臟組織(或細(xì)胞)明顯減低,notch1的表達(dá)明顯增高;mir-34a通過負(fù)相關(guān)調(diào)節(jié)靶蛋白notch