肺動(dòng)脈高壓患者BMPR-,2-基因啟動(dòng)子及外顯子突變的研究.pdf

1、目的：
　　 骨形成蛋白II型受體(Bone morphogenetic protein type II receptor，BMPR2)基因突變是家族性肺動(dòng)脈高壓(Familial pulmonary arterialhypertension，F(xiàn)PAH)及特發(fā)性肺動(dòng)脈高壓(Idiopathic pulmonary arterialhypertension，IPAH)的重要致病原因，然而，部分肺動(dòng)脈高壓患者雖然沒(méi)有發(fā)生BMPR2基

2、因外顯子突變但卻基因表達(dá)低下，由于啟動(dòng)子是基因表達(dá)的主要調(diào)控區(qū)，因此，我們推測(cè)BMPR2基因啟動(dòng)子突變可能與這些患者基因表達(dá)低下有關(guān).本研究擬探討：1、FPAH及IPAH患者是否存在BMPR2基因啟動(dòng)子突變？2、BMPR2基因啟動(dòng)子突變對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性的影響如何？3、FPAH及IPAH患者BMPR2基因外顯子突變。探討B(tài)MPR2基因啟動(dòng)子及外顯子突變與肺動(dòng)脈高壓發(fā)病的關(guān)系。
　　 方法：
　　 以2004至2007年在中國(guó)醫(yī)

3、學(xué)科學(xué)院阜外心血管病醫(yī)院和解放軍總醫(yī)院住院、經(jīng)右心導(dǎo)管檢查確診的20例肺動(dòng)脈高壓患者為研究對(duì)象，其中FPAH1例，IPAH19例。診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2004年美國(guó)胸科醫(yī)師協(xié)會(huì)(ACCP)制定的肺動(dòng)脈高壓的診斷和治療指南，以50名成年健康體檢者為對(duì)照組。
　　 1、分析FPAH及IPAH患者BMPR2基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)構(gòu)及突變篩查：采集20例肺動(dòng)脈高壓患者和50名健康成人外周血并提取DNA，設(shè)計(jì)BMPR2基因啟動(dòng)子序列引物，對(duì)20例肺動(dòng)脈

4、高壓患者和50名健康成人的BMPR2基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-2022 bp進(jìn)行擴(kuò)增扣DNA序列測(cè)定.結(jié)果在1例36歲女性FPAH患者發(fā)現(xiàn)BMPR2基因啟動(dòng)子區(qū)雜合子突變-142G>A。
　　 2、分析BMPR2基因啟動(dòng)子突變-142G>A對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性的影響及其產(chǎn)生機(jī)制：分別將-142G>A突變型和野生型BMPR2基因啟動(dòng)子區(qū)片段插入pGL3-basic雙熒光素酶報(bào)告基因載體中，獲得pGL3-BMPR2啟動(dòng)子-突變型重組質(zhì)粒和

5、pGL3-BMPR2啟動(dòng)子-野生型重組質(zhì)粒，將2種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(Human pulmonary arterial smooth muscle cell，HPASMC)和人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human pulmonary arterial endothelial cell，HPAEC)，用Veritas微孔板發(fā)光檢測(cè)儀檢測(cè)突變型和野生型BMPR2基因啟動(dòng)子區(qū)片段在兩種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性(結(jié)果以Firefly熒光素酶/

6、Renilla熒光素酶活性比值表示).應(yīng)用MAPPER軟件分析突變型和野生型BMPR2基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 3、肺動(dòng)脈高壓患者BMPR2基因外顯子突變檢測(cè)：采集20例肺動(dòng)脈高壓患者和50名健康成人外周血并提取DNA，設(shè)計(jì)BMPR2基因外顯子1-13含側(cè)翼內(nèi)含子序列引物，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后DNA測(cè)序，與正常BMPR2基因序列比較。
　　 結(jié)果：
　　 1、在1例36歲女性FPAH患者的BMPR2

7、基因啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)雜合子突變-142G>A，但外顯子未見(jiàn)突變。
　　 2、BMPR2基因啟動(dòng)子-142G>A突變型(轉(zhuǎn)錄活性分別為9.58±3.85與59.07±25.54，P<0.05)在HPASMC和HPAEC中的轉(zhuǎn)錄活性均明顯低于野生型(轉(zhuǎn)錄活性分別為16.80±3.55與115.58±38.02，P<0.05)，其產(chǎn)生機(jī)制有可能為BMPR2基因啟動(dòng)子-142G>A突變型缺失轉(zhuǎn)錄因子SP3結(jié)合位點(diǎn)。
　　 3、在19

8、例IPAH患者BMPR2基因外顯子篩查中，有3例患者發(fā)現(xiàn)了3種BMPR2基因新型外顯子雜合子突變：即外顯子3的第292位核苷酸發(fā)生無(wú)義突變(Glu98X)；外顯子5的第608-609位核苷酸缺失TG導(dǎo)致移碼突變(Leu203fsX15)；外顯子12發(fā)生錯(cuò)義突變導(dǎo)致單個(gè)堿基置換(Ser863Asn)。1例患者在外顯子2第196位核苷酸發(fā)生錯(cuò)義突變導(dǎo)致的單個(gè)堿基置換(Cys66Arg).以上患者均無(wú)BMPR2基因啟動(dòng)子突變。
　　

9、結(jié)論：
　　 1、1例FPAH患者存在BMPR2基因啟動(dòng)子突變-142G>A，提示BMPR2基因啟動(dòng)子突變可能與FPAH發(fā)病有關(guān)。這是首次報(bào)道肺動(dòng)脈高壓患者存在BMPR2基因啟動(dòng)子突變。
　　 2、BMPR2基因啟動(dòng)子-142G>A突變型的轉(zhuǎn)錄活性明顯低于野生型，其產(chǎn)生機(jī)制有可能為其缺失轉(zhuǎn)錄因子SP3結(jié)合位點(diǎn).初步揭示了BMPR2基因啟動(dòng)子突變?cè)贔PAH發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 3、在我國(guó)IPAH患者中發(fā)現(xiàn)了BM