血管內皮生長因子及其受體2在支氣管哮喘氣道平滑肌細胞增殖中作用的研究.pdf

1、目的：氣道重建是支氣管哮喘(簡稱哮喘)除氣道慢性炎癥之外的另一重要特征，氣道平滑肌作為氣道壁的重要組成成分，其增殖在哮喘氣道重建中起著重要作用，是不可逆性氣流阻塞、持續(xù)性氣道高反應性的重要病理基礎。因此，探討氣道平滑肌細胞(airwaysmoothmusclecell，ASMC)增殖的細胞內信號轉導途徑以明確哮喘發(fā)病機制、尋找更有效治療方法，成為目前國內外哮喘研究的熱點。 血管內皮生長因子(VEGF)是最有效的血管生成因子之一，

2、它可增加微血管的通透性，特異性的與血管內皮細胞受體結合，促進血管內皮細胞的分裂和增殖，進而導致新生血管的生成。大鼠VEGF基因經過轉錄后剪切可產生5種不同的轉錄子，分別編碼120,144,164,188和205個氨基酸多肽組成的5種亞型。VEGF通過受體來發(fā)揮其作用，目前已知VEGF有3種受體：VEGF受體1(Flt-1)，受體2(KDR/Flk-1)和受體3(Flk-4).這三種受體同屬酪酸激酶受體，不同的受體可介導VEGF不同的生物

3、學功能。其中KDR/Flk-1與細胞增殖關系密切。 過去認為VEGF生長作用只針對內皮細胞。目前國外研究發(fā)現，VEGF不僅對內皮細胞而且對血管平滑肌細胞，上皮細胞，成纖維細胞及腫瘤細胞都有增殖作用。但迄今國內外均無對VEGF及其受體在氣道平滑肌細胞增殖中作用的研究。 糖皮質激素已被證實在抑制哮喘氣道炎癥方面是最有效的藥物。而糖皮質激素對哮喘氣道重建的影響還在深入的觀察之中，研究結果也不甚一致。 目前國內外通常是分

4、別研究與哮喘有關的各種影響因子對非哮喘ASMC增殖的影響，但由于非哮喘ASMC和哮喘ASMC的表型和功能狀態(tài)存在差異，這種在體外分別以單一因子誘導非哮喘ASMC增殖來推斷哮喘ASMC體內的增殖特性的方法尚存在一定局限性。故以來自哮喘個體的ASMC為研究對象可能更準確地反映體內ASMC增殖的途徑。同時，由于哮喘患者的氣道平滑肌細胞很難獲得，國外研究者把培養(yǎng)的人ASMC和變應性哮喘患者血清孵育，為研究哮喘發(fā)病機制提供了一個很好的被動致敏哮喘

5、模型。 因此，本研究擬通過動物實驗和人體細胞實驗，評價哮喘大鼠ASMC及被動致敏的人ASMC的增殖特性，探討VEGF及其受體2(KDR/Flk-1)是否參與其增殖，為進一步明確哮喘發(fā)病機制、尋找更有針對性的治療方法提供理論依據。 方法：本研究通過建立大鼠哮喘模型；培養(yǎng)哮喘大鼠ASMC；通過哮喘患者血清被動致敏人氣道平滑肌細胞(ASMC)，采用流式細胞術分析細胞周期、MTT法及免疫熒光或組織化學技術檢測細胞增殖細胞核抗原(

6、PCNA)表達以檢測上述細胞增殖活性；RT-PCR技術檢測細胞VEGF及其受體2(KDR/Flk-1)mRNA的表達；Westernblot檢測VEGF及其受體2(KDR/Flk-1)蛋白的表達等方法，評價哮喘大鼠ASMC及被動致敏人ASMC的增殖特性，探討VEGF及其受體2(KDR/Flk-1)是否參與其增殖，以及糖皮質激素在治療哮喘氣道重建中的作用，以更準確地反映哮喘ASMC增殖的調控機制。 結果：1.大鼠哮喘模型組氣道平滑

7、肌的厚度明顯大于對照組和地塞米松干預組(P＜0.05)。給予地塞米松早期治療的干預組大鼠氣道平滑肌增殖較哮喘模型組明顯減輕(P＜0.05)。 2.大鼠哮喘模型組VEGF205，188,144mRNA及VEGF蛋白質水平的表達明顯高于對照組和地塞米松干預組(P＜0.05或P＜0.01)，并且與氣道壁平滑肌厚度呈正相關(r分別為0.739，0.747，0.744,0.693；P＜0.05)。大鼠哮喘模型組Flk-1mRNA及蛋白質水

8、平的表達明顯高于對照組和地塞米松干預組(P＜0.05)，并且與氣道壁平滑肌厚度呈正相關(r分別為0.682，0.672；P＜0.05)。 3.哮喘模型組大鼠ASMC增殖顯著高于對照組和地塞米松干預組(P＜0.05)。哮喘模型組大鼠ASMCVEGF164,188,205及其受體Flk-1mRNA,以及VEGF及其受體Flk-1蛋白的表達顯著高于對照組和地塞米松干預組(P＜0.01或P＜0.05)。哮喘模型組大鼠ASMC的增殖與哮喘

9、模型組大鼠ASMCVEGF164，188，205及其受體Flk-1mRNA的表達呈正相關(r分別為0.79，0.86，0.83，0.682，P＜0.05)；和VEGF及其受體Flk-1的蛋白表達呈正相關(r分別為0.80，0.77；P＜0.05)。 4.哮喘血清被動致敏的人ASMC增殖顯著高于對照血清處理的對照組和地塞米松處理的干預組(P＜0.05)。被動致敏的人ASMCVEGF121，165，189及其受體KDRmRNA，以及

10、VEGF及其受體KDR蛋白的表達顯著高于對照血清處理組和地塞米松處理組(P＜0.05)。哮喘血清被動致敏的人ASMC的增殖與哮喘血清被動致敏的人ASMCVEGF121，165,189及其受體Flk-1的mRNA表達呈正相關(r分別為0.73，0.82，0.77，0.70，P＜0.05)；與VEGF及其受體Flk-1的蛋白表達呈正相關(r分別為0.69，0.67；P＜0.05)。 5.在無血清的情況下，VEGF在體外可以引起人的氣

11、道平滑肌細胞的增殖，并且這種增殖效應可以被抗KDR抗體幾乎完全阻斷。 6.在大鼠哮喘模型組BALF中VEGF水平，嗜酸粒細胞百分數，氣道反應性(PC50)，氣道血管滲透指數明顯高于對照組和地塞米松治療組(P＜0.05或P＜0.01)；其VEGF水平與PC50呈反相關(r=-0.68，P＜0.01)；其VEGF水平與氣道血管滲透指數呈正相關(r=0.84,P＜0.01)；其VEGF水平與氣道嗜酸粒細胞百分數呈正相關(r=0.76,

12、P＜0.01)。 結論：1.慢性哮喘存在氣道平滑肌的增厚。2.在體內VEGF及其受體Flk-1參與了哮喘氣道平滑肌的增殖的過程。3.哮喘大鼠ASMC及哮喘血清被動致敏的人ASMC增殖活性增加。4.VEGF及其受體2(Flk-1/KDR)參與哮喘大鼠ASMC和被動致敏的人ASMC增殖過程。5.在哮喘氣道中高表達的VEGF，與哮喘的嗜酸粒細胞炎癥有關，而且致氣道反應性增高及氣道血管滲透性增高從而導致了氣道縮窄。6.地塞米松可通過降低