微囊漏斗形流化床式生物反應器創(chuàng)建及體外初步評價研究.pdf

1、重型肝炎病情危重，預后兇險，其治療是臨床上一大難題。生物型人工肝(bioartificialliver，BAL)理論上講可以代償肝臟的全部功能，構建BAL已經成為人工肝研究領域治療重型肝炎的熱點。生物反應器是生物人工肝的核心裝置。目前應用最多的是中空纖維生物反應器，但是難以放大且半透膜致使物質彌散障礙等都限制了其應用。微囊肝細胞培養(yǎng)的流化床反應器是必然的選擇。 BAL欲得到臨床應用，必須容易“放大”，約需1010數量級的肝細胞數

2、。傳統(tǒng)體外培養(yǎng)方法難以達到，另外還必須解決免疫排斥問題。生物微膠囊具有選擇性物質通透性，允許營養(yǎng)成分及小分子物質自由通過，并且有免疫隔離效果。目前微囊技術已廣泛用于生物人工肝研究。 目前轉瓶大規(guī)模微囊肝細胞培養(yǎng)國內外均未見報道，而適合微囊肝細胞的反應器為流化床式生物反應器，流化床的流化作用能使體外循環(huán)液充分接觸微囊化肝細胞進行物質交換和物質代謝。傳統(tǒng)的固化床液體流動時具有剪切力大，物質交換效率低，易于形成無效腔和死腔等缺點。并且

3、其結構多為圓柱體狀，液體流化時的不均一性，存在邊際效應，導致無效腔形成。我們設計并研制了一種基于改善流化床反應器徑向傳遞性能及混合效果和便于規(guī)模化應用的一套漏斗形新型結構流化床反應器。 本研究旨在建立微囊永生化肝細胞大規(guī)模高活性培養(yǎng)體系；構建新型漏斗形流化床式反應器及對其結構參數的研究：使用體外培養(yǎng)基循環(huán)以及重型肝炎血漿模型對此構建的生物反應器進行體外評價，為今后進一步實驗提供理論基礎。 第一部分微囊化永生化肝細胞的大規(guī)

4、模轉瓶培養(yǎng)及評價 目的：本研究旨在建立一種大規(guī)模海藻酸/殼聚糖(AC)微囊化肝細胞的轉瓶培養(yǎng)體系，并對大規(guī)模微囊化肝細胞進行功能評價研究。 方法：AC微囊的表征測定(機械強度、物質滲透性免疫隔離作用)、一步法大規(guī)模包裹制備微囊永生化肝細胞，微囊肝細胞與裸細胞轉瓶培養(yǎng)20天，動態(tài)評價微囊肝細胞增殖能力及物質代謝功能。 結果：AC微囊能承受高速振蕩剪切力的作用而保持形態(tài)完整；不僅能對小分子物質如白蛋白自由通過，而且阻

5、止免疫球蛋白的釋放。與裸細胞培養(yǎng)比較，大規(guī)模轉瓶培養(yǎng)AC微囊肝細胞能改善細胞的生長代謝及功能(白蛋白合成、氨代謝以及利多卡因清除能力)。 結論：建立了一種大規(guī)模AC微囊化肝細胞的轉瓶培養(yǎng)體系；一步法大規(guī)模制作的AC微囊性能可靠；轉瓶培養(yǎng)微囊化肝細胞功能在2周左右達到最佳狀態(tài)，此培養(yǎng)模式的建立有應用生物人工肝支持系統(tǒng)的廣闊前景。 第二部分新型漏斗形流化床式反應器初步研制及結構參數研究 目的：本研究旨在設計一種符合流

6、體力學的漏斗形生物反應器，通過微囊置于反應器中在模擬體外循外灌流狀態(tài)下摸索反應器的適宜流化參數。 材料與方法：自行設計一定高度和錐度的漏斗形流化床式生物反應器，計算反應器結構參數；觀測微囊在流化床流化狀態(tài)的變化情況。排液體積法測定循環(huán)液氣含率，測定流化床表觀速率、最佳流化高度、觀察微囊流化8小時后的完整性。 結果：自行設計的漏斗形反應器容積約550ml，高度25cm，錐度92達到最佳流化狀態(tài)大致分四個過程：固化床、起始流

7、化床、循環(huán)床、完全循環(huán)流化床。流化床的氣含率隨著微囊的固含率增加，氣含率隨之增加，300g/L微囊固含率時氣含率達到最大，而后固化率增加氣含率緩慢下降。最佳流化高度為23cm時，泵速為85ml/min，微囊的流化速率為1.19cm/s。流化8小時，微囊完整性在97％以上。 結論：流化床式反應器作為承載微囊化人工肝適宜的生物反應器，流化床的流化參數直接影響到流化效果，對這些參數的探索對今后微囊流化床生物反應器的應用于生物人工肝研究

8、具有指導意義。 第三部分新型微囊漏斗形流化床式反應器體外初步評價 目的：應用培養(yǎng)基循環(huán)驗證流化床反應器流化作用對肝細胞功能代謝的影響；應用廢棄重型肝炎血漿模型對新構建的生物反應器進行評價，觀察流化床微囊化肝細胞對重肝血漿的代謝作用以及二者的相互影響。為下一步動物實驗奠定基礎。 材料與方法：正確建立體外循環(huán)，將培養(yǎng)2周的微囊化肝細胞分為兩組(培養(yǎng)基體外培養(yǎng)組和流化床組)，實驗組微囊肝細胞置于流化床式生物反應器中，D

9、MEM高糖完全培養(yǎng)基1000ml體外循環(huán)12小時，動態(tài)檢測上清中的ALT、LDH以及白蛋白的水平；重型肝炎血漿置換術后的被置換血漿，作為微囊生物人工肝治療的血漿模型。將總量約5×109活率在90％以上的微囊肝細胞置于流化床反應器，稀釋50％的血漿體外循環(huán)6小時，實驗前后測定血漿中ALT、TBi、DBi、ALB變化以及微囊肝細胞的活性以及電鏡觀察肝細胞的微觀結構變化情況。 結果：體外培養(yǎng)基循環(huán)12小時的評價中ALT、LDH水平均有

10、上升，靜止培養(yǎng)組ALT上升更為明顯，兩組相比有顯著性差異(H4，p＜0.01；H6，p＜0.05；H12，p＜0.01)．兩組白蛋白的合成均有不同程度增多，流化床組升高更為明顯(H6，p＜0.01；H12，p＜0.05)，與此同時，靜止培養(yǎng)組和流化床組從6小時后白蛋白合成量較前比較明顯增多，差異有統(tǒng)計學意義(p＜0.05或者p＜0.01)。微囊流化床組實驗前肝細胞活率平均為93.5±3.2％，循環(huán)12小時后肝細胞活率為90.6±6.5％

11、(P＞0.05)。而培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)組實驗前肝細胞活率平均為93.9±4.4％，實驗結束后微囊肝細胞活率略有下降，平均為87.8±3.8％，但沒有統(tǒng)計學意義。 廢棄血漿體外循環(huán)功能評價顯示：微囊流化床流化6小時后ALT水平無明顯上升，靜止培養(yǎng)組ALT有明顯的升高，兩組相比有顯著性差異(H6，p＜0.05)，而靜止培養(yǎng)組中ALT水平較實驗前有明顯上升(p＜0.05)。體外靜止培養(yǎng)組治療前后總膽紅素及直接膽紅素無明顯下降；而漏斗形流化

12、床組則6小時體外循環(huán)后相比靜止培養(yǎng)組有明顯的下降(p＜0.05)。此外，漏斗形流化床組在治療前后膽紅素也有一定程度下降(p＜0.05)，具有統(tǒng)計學意義。兩組中白蛋白無明顯變化。微囊流化床組循環(huán)6小時后肝細胞活率有明顯下降(p＜0.05)；靜止培養(yǎng)組實驗結束后微囊肝細胞活率明顯下降，有顯著性差異(p＜0.01)。兩組在實驗結束后活率比較，靜止培養(yǎng)組肝細胞活率下降明顯，具有顯著性差異(p＜0.05)。廢棄血漿靜止培養(yǎng)的微囊化肝細胞實驗結束后