醫(yī)用殼多糖表面包覆技術處理納米氧化鐵磁珠的技術研發(fā).pdf

1、背景:
　　核酸是儲存、復制和傳遞遺傳信息的物質(zhì)基礎,是生物體正常的生長、發(fā)育、繁殖、以及遺傳和變異等一系列重大生命活動的關鍵物質(zhì),同時參與生命體的各種病理活動。因此無論對核酸結構、功能進行研究,還是對基因工程、蛋白質(zhì)工程等進行研究,對核酸進行分離純化是首要解決的問題。核酸提取基本原理是利用各種方法,破裂細胞壁或細胞膜,使染色體及蛋白質(zhì)發(fā)生變性反應,再用某些有機溶劑萃取核酸,然后經(jīng)過沉淀、洗脫等過程,從而獲取核酸。傳統(tǒng)的核酸分離技

2、術包含沉淀和離心等過程,該純化方法的步驟繁雜、耗時長、提取率低,提取過程中會接觸到有毒試劑,自動化程度低;而采用磁性載體微球分離技術則可較好的避免這些缺點,可實現(xiàn)核酸的高效、快速提取,是今后核酸純化方法發(fā)展的一個重要方向。
　　納米磁珠純化技術與20世紀70年代興起,納米磁性顆粒因其獨特的性能,在生物醫(yī)學領域得到了廣泛應用,如細胞分離、核酸提取、藥物載體與免疫識別等。納米磁珠一般由磁性內(nèi)核及高分子外殼構成,可在磁場中定向運動,且可

3、與多種活性物質(zhì)結合,如抗原、核酸、抗體等結合,因此納米磁珠是提取核酸優(yōu)良的載體。納米磁珠法提純核酸不需要離心和使用有機溶劑,操作安全簡單。但目前磁珠提取核酸分子的試劑盒以及儀器費用較高,難以在臨床核酸提取中得到普及應用。因此,研發(fā)一種種基于納米磁珠為介質(zhì)的新型核酸吸附-提取技術具有重要的臨床意義。我們根據(jù)傳統(tǒng)核酸提取技術的不足,自主研發(fā)了基于現(xiàn)有比較成熟的磁珠提取技術-納米氧化鐵磁珠表面包覆醫(yī)用殼聚糖新型磁珠的提取技術,為人體全血核酸的

4、提取提供了簡易便捷的新方法。
　　目的:
　　研制一種新型殼聚糖納米氧化鐵磁珠,檢測其理化性能,并觀察其在提取人血DNA檢測中的應用效果。
　　方法:
　　采用凝聚沉淀的方法,通過在納米氧化鐵磁珠表面包覆一層殼聚糖分子,制備出殼聚糖納米氧化鐵磁珠。對磁珠的粒徑大小、顯微特征、殼聚糖外殼和磁珠內(nèi)核的關系以及殼聚糖磁珠的理化性能進行檢測、分析;采購人體全血標本,分別用殼多糖表面納米氧化鐵磁珠及硅基磁珠提取人血標本DN

5、A,并用凝膠成像分析系統(tǒng)觀察及核酸微量測定儀分析。
　　結果:
　　1.電鏡下觀察殼聚糖表面包覆納米氧化鐵磁珠,磁珠分散性良好,無凝聚成團,覆蓋約70％。
　　2.在透射電子顯微鏡下可見,殼聚糖納米氧化鐵磁珠呈圓形顆粒狀,形態(tài)、大小基本一致,磁珠分布均勻,粒徑約在100~200nm之間。
　　3.XRD檢測結果顯示其衍射峰位置與標準參數(shù)相一致,這些特征峰衍射角2θ出現(xiàn)在18.5°、30.2°、35.6°、37.2

6、°、43.0°、53.4°、57.1°和62.5°分別對應于的晶面指數(shù)(111)、(220)、(311)、(222)、(400)、(422)、(511)和(440),而且沒有其它雜質(zhì)峰出現(xiàn),說明樣品中所含磁性核心為Fe3O4,單相立方晶型,產(chǎn)物純度高。
　　4.紅外光譜圖顯示,殼聚糖納米氧化鐵磁珠的特征吸收峰出現(xiàn)在約3400cm-1、2370cm-1、1630cm-1和1080cm-1處,這與殼聚糖所帶的基分子間氫鍵、甲基、酮羰基

7、、醇羥基相對應,證明殼聚糖被包覆在磁珠表面,且通過氫鍵范德華力和靜電作用等方式結合。
　　5.過真空干燥后的粉末殼聚糖包覆納米氧化鐵磁珠的磁滯回線。結果顯示磁珠的磁化強度在場強為-18000Oe時開始提高,-3000Oe~3000Oe區(qū)間提升最為明顯,在20000Oe時基本達到飽和程度,該磁滯回線呈一條曲線、矯頑力趨近于零、幾乎沒有磁滯,具有良好的超順磁性,飽和磁化強度為52.9emu/g。
　　6.殼聚糖納米氧化鐵磁珠在交

8、變磁場中,隨著時間的延長,其溫度逐漸上升,溫度與時間呈線性相關。
　　7.異丙醇替代液組的磁珠提取人血DNA電泳條帶明顯比原結合液組清晰,且異丙醇替代液組其260nm吸光度值(260nmAbs)及目標DNA濃度(conc)明顯高于原結合液組,證明異丙醇在DNA提取過程中起到了優(yōu)化作用。
　　8.殼聚糖納米氧化鐵磁珠每條跑道上均可見DNA條帶片段,硅基磁珠電泳條帶更清晰、明亮;殼聚糖納米氧化鐵磁珠組其260nmAbs及conc

9、值均明顯低于硅基納米氧化鐵磁珠組(p<0.05),提示殼聚糖納米氧化鐵磁珠提取的全血DNA濃度較低,提取效果不如硅基納米氧化鐵磁珠。同時發(fā)現(xiàn),殼聚糖納米氧化鐵磁珠組其OD260/280為1.8713±0.0825,提示不存在RNA、蛋白質(zhì)、酚等污染,但OD260/230為0.4613±0.0770,明顯低于2.0,提示提取的DNA樣品中可能有鹽和小分子雜質(zhì),如核苷酸、氨基酸、酚等污染。
　　結論:
　　成功制備了新型殼聚糖納